بخشی از مقاله
چکیده
مقدمه: متابولیتهاي ثانویه موادي هستند که براي رشد میکروارگانیسمی که آنها را تولید میکند لازم نبوده و داراي ساختارهاي بسیار متنوعی میباشند. این مواد توسط گروههاي مشخصی از ارگانیسمها تولید میشوند که از جمله این ارگانیسم ها باکتري سراشیا مارسه سنس میباشد که پیگمان پروديژیوزین را که جزء متابولیتهاي ثانویه بوده و در بسیاري از مطالعات به اثرات ارزشمند آن به عنوان ضد قارچ، ضد باکتري ها، ضد مالاریا و ... اشاره شده است را تولید میکند. تولید پروديژیوزین ها، به بسیاري از فاکتورها از جمله: زمان انکوباسیون، دماي انکوباسیون، pH محیط کشت، میزان هوادهی و ... بستگی دارد.
هدف: در این مطالعه تأثیر عوامل فیزیکی از جمله دماي انکوباسیون، pH و میزان هوادهی بر روي میزان تولید پیگمان پرودي ژیوزین به منظور افزایش تولید این پیگمان و به کارگیري آن جهت کاربردهاي بیولوژیک فراوان آن، مورد بررسی قرار گرفت. روش: پس از رسم منحنی رشد باکتري، میزان تولید پیگمان در محیط کشت پودر بادام زمینی، در دو دماي 28 و 30 درجه سانتی گراد، در سه pH، 7/5، 8 و 8/5 و در سه دور 170 rpm، 150 و 130 شیکر انکوباتور مورد مطالعه قرار گرفت. براي محاسبه میزان تولید پیگمان پرودي ژیوزین از روش Morohoshi استفاده گردید.
نتیجه: نتایج نشان داد که بیشترین میزان تولید پیگمان پروديژیوزین در دماي 30 درجه سانتیگراد با میزان تولید - μM - 63/102، در pH 8 با میزان تولید 73/256 - μM - و در دور 170 rpm با میزان تولید 60/066 - μM - میباشد.
کلمات کلیدي: متابولیت ثانویه، پیگمان پروديژیوزین، سراشیا مارسه سنس
مقدمه
کنترل بیولوژیکی عوامل بیماريزاي گیاهی، بیماريهایی را کنترل میکنند که نمیتوان آنها را توسط استراتژيهاي کنترل کنندهي دیگر اداره کرد یا فقط تا حدي قابل کنترل میباشند. در حقیقت استفاده از مبارزه بیولوژیک در سراسر جهان به ویژه کشورهاي توسعه یافته به عنوان بهترین رویکرد در کاهش مصرف سموم وکودهاي شیمیایی، کشاورزي پایدار و حفاظت از محیط زیست و پیشگیري از پیدایش گونههاي آفات و بیماريهاي مقاوم در عرصه کشاورزي مطرح میباشد . - 1 - با توجه به موارد گفته شده، اهمیت استفاده از روشهاي کنترل بیولوژیکیکاملاً بارزو مشهود میباشد. استفاده از روشهاي کنترل بیولوژیکی به ویژه استفاده از میکروارگانیسمها و متابولیت هاي آن ها براي کنترل آفات و بیماريهاي گیاهی به عنوان روشی مطلوب، همواره مورد توجه زیست شناسان بوده است. در نتیجه افزایش میزان تولید این متابولیت ها مورد توجه دانشمندان بوده است . لذا در این پروژه سعی در افزایش میزان تولید پیگمان پرودي ژیوزین که از جمله متابولیت هاي مورد استفاده در بیوکنترل بیماریزاهاي هاي گیاهی می باشد، شده است. پرودي ژیوزینها، جزء متابولیتهاي ثانویه چند منظوره هستند. این متابولیتها، خانوادهاي از پیگمانهاي طبیعی هیدروفوب و نامحلول در آب میباشند که داراي اسکلت پیرولیل پیرومتان می باشند. این پیگمان از سه جزء قرمز رنگ و یک جزء آبی رنگ تشکیل شده است. پروديژیوزینها در آب غیرمحلول و در الکل خالص، اتر، کلروفرم و استون حل میشوند و در نتیجه میتوان آنها را با حلالهاي آلی، اتر، نفت خام، کلروفرم، استون، اتانول و متانول استخراج کرد . - 2 - پروديژیوزینها، داراي اثرات بیولوژیکی متعددي میباشند، از جمله: اثرات ضد قارچی، ضد باکتریایی، ضد مالاریا، ضد پروتوزوآ، ضد دیابت ملیتوس، ایمونوساپرسیو و سایتوتوکسیک و هم چنین فعالیت ضد توموري این پیگمان نیز به اثبات رسیده است . - 3 - تولید پیگمان در میان گونههاي مختلف بسیار متنوع است و همانند سایر اعمال فیزیولوژیکی باکتري، وابسته به فاکتورهاي متعددي از جمله: نوع گونه، زمان گرماگذاري، دما، شرایط روشنایی، نوع محیط کشت، ترکیب محیط کشت، حضور یونهاي مختلف، حضور دترجنتهاي آنیونی و آمینواسیدها میباشد . - 4 -
مواد و روش ها
منحنی رشد سراشیا مارسه سنس به منظور تعیین زمان رسیدن باکتري به اواخر فاز لگاریتمی و اوایل فاز سکون جهت بررسی میزان تولید پیگمان پرودي ژیوزین رسم شد . براي رسم منحنی رشد، ارلن هاي 500 میلی لیتري حاوي 100 میلی لیتر محیط کشت نوترینت براث با pH 8 تهیه و به وسیله کشت 24 ساعته باکتري سراشیا مارسه سنس به میزان 10% تلقیح شدند. پس از هم زدن ارلن ها، اولین نمونه برداري در زمان صفر انجام شد و سپس ارلن ها در دماي 28 درجه سانتی گراد و دور 150 rpm شیکر انکوباتور قرار داده شدند و میزان رشد باکتري در طول موج 600 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفوتومتر محاسبه گردید - . - 5 ابتدا باکتري سراشیا مارسه سنس PTCC1111 در20 میلی لیتر محیط کشت نوترینت براث کشت داده شد و سپس به مدت 15ساعت در دماي 28 درجه سانتی گراد درون انکوباتور قرار داده شد. سپس میزان 1% از این محیط کشت، به محیط کشت پودر بادام زمینی درون ارلن هاي 100 میلی لیتري حاوي 20 میلی لیتر آب مقطر استریل شده با pH 8، تلقیح شد. ارلن ها با فویل آلومینیومی پوشانده شدند به دلیل این که پیگمان پرودي ژیوزین به نور حساس می باشد. ارلن ها به مدت 20 ساعت درون شیکر انکوباتور با دور 150 rpm و دماي 28 درجه سانتی گراد قرار داده شدند و سپس جهت محاسبه میزان تولید پیگمان مورد نظر، میزان جذب هر کدام از محلول هاي موجود در ارلن ها در طول موج 600 نانومتر، خوانده شدند. سپس محلول هاي فوق به درون فالکون هاي استریل ریخته شده و به مدت 5 دقیقه در دور 13000 rpm سانتریفوژ شدند. پس از آن قسمت هاي شناور دور ریخته شدند و بر روي رسوب هاي باقی مانده در ته فالکون، هم حجم محلول هاي موجود در فالکون، HCl 4% یک مولار در اتانول اضافه شد و سپس توسط ورتکس به خوبی شیک شدند
تا رسوب ها کاملاًً حل شوند و مجدداً به مدت5دقیقه در دور 13000 rpm سانتریفوژ شدند. این بار رسوب کنار گذاشته شد و قسمت هاي شناور خارج شدند و جذب نوري آن ها در طول موج 534 نانومتر خوانده شدند 6 - و . - 7 از تقسیم میزان جذب پرودي ژیوزین پس از استخراج در 534 نانومتر به میزان جذب آن قبل از استخراج در 600 نانومتر، میزان تولیدهاي پیگمان مذکور به دست آمد . - 7 - با توجه به تولید بالاي پیگمان در محیط پودر بادام زمینی، فاکتورهاي فیزیکی مانند دما، pH، میزان دور شیکر انکوباتور بر میزان تولید آن در این محیط بررسی شد.
تأثیر دما میزان تولید پیگمان در دو دماي 28 و 30 درجه سانتی گراد در محیط کشت پودر بادام زمینی، مورد مطالعه قرار گرفت . - 8 -
تأثیر pH
میزان تولید پرودي ژیوزین در سه pH، 7/5، 8 و 8/5 در محیط کشت پودر بادام زمینی، مورد بررسی قرار گرفت . - 8 -
تأثیر میزان دور شیکر انکوباتور میزان تولید پیگمان در سه دور 170 rpm، 150 و 130 شیکر انکوباتور در محیط کشت پودر بادام زمینی نوع، مورد مطالعه قرار گرفت . - 8 -
نتایج و بحث
تأثیر دما
تولید پیگمان پرودي ژیوزین در دماي 28 و 30 درجه سانتی گراد، در محیط پودر بادام زمینی با pH 8 و دور 150 rpm شیکر انکوباتور را پس از 20 ساعت نشان می دهد. همان طور که مشاهده می شود، بیش ترین میزان تولید پیگمان در دماي 30 درجه سانتی گراد با میزان تولید 63/102 - μM - به دست آمد.
تأثیر میزان دور شیکر انکوباتور
تولید پیگمان پرودي ژیوزین در محیط پودر بادام زمینی با pH 8، در دورهاي 170, 150, 130 rpm و دماي 30 درجه سانتی گراد شیکر انکوباتور را پس از 20 ساعت نشان می دهد. همان طور که مشاهده می شود، بیش ترین تولید پیگمان در دور 170 rpm با میزان تولید 60/066 - μM - به دست آمد.
