بخشی از مقاله
چکیده مقاله:
مقدمه: این مطلب که تک یاخته تیلریا تنها یوکاریوتی است که به طور اختصاصی و برگشت پذیر توانایی ترانسفورم کردن سلول هاي لنفوسیتی میزبان خود را دارد به عنوان یک فرضیه تایید شده قلمداد میگردد بدین معنا که اگر به هر دلیل رده سلولی حاوي تیلریا از این تک یاخته پاك گردد، سلول حالت نامیرایی خود را از دست داده وقادر به ادامه تکثیر به صورت نامحدود نمی باشد .
هدف: با توجه به شواهد تجربی بدست آمده، هدف از این پژوهش بر خلاف فرضیه مطرح شده تولید رده هاي سلولی می باشد که پس از پاك شدن تیلریا همچنان به صورت رده هاي سلولی باقی بمانند.
روش: در این پژوهش سه رده سلولی که لنفوسیتهاي گاو حاوي تیلریا بودند با روش هاي ابتکاري شامل تغییر دما،تغییر نحوه پاساژ و استفاده از آنتی بیوتیک ضد تک یاخته از تیلریا پاك گردیدند وسپس هویت رده هاي سلولی جدید با روش هاي مولکولی و کاریوتایپ تعیین شد.
نتیجه تحقیق: این پژوهش منجر به تولید سه رده سلولی جدید گردید که هم از لحاظ ژنوتیپی - عدد کاریوتیپ - و هم از لحاظ فنوتیپی - از حالت معلق به شکل چسبنده در آمدند - با رده هاي سلولی اصلی متفاوت بودند. این اولین گزارشی است که رده هاي سلولی حاوي تیلریا پس از حذف تک یاخته مذکور همچنان به صورت رده سلولی باقی مانده اند. این یافته ها علاوه بر جنبه هاي کاربردي می تواند در تحقیقات بنیادي در رابطه با نحوه عملکرد تیلریا نیز بسیار راهگشا باشد.
مقدمه:
تک یاخته تیلریا زیر شاخه اي از انگل هاي راسته Appicomplexa ، شاخه Piroplasma می باشد. . پاتوژنز بیماري مربوط به توانایی انگل براي ترانسفورم کردن لوکوسیت هاي میزبان و القاء تکثیر غیر قابل کنترل آن ها بدون نفوذ به ژنوم میزبان می باشد که این دگرگونی مربوط به اختلال در مسیرهاي انتقال سیگنال وکمپلکس هاي تنظیمی چرخه سلولی لوکوسیت توسط انگل می باشد - 14،13،. - 8 اطلاعات موجود نشان می دهند شیزونت1 تیلریا با فعال کردن بیان پروتئین هاي ضد آپوپتوز از جمله c-FLIP1 ،XIAP مانع از آپوپتوز2 سلول هاي آلوده می شود - - 5 اما با وجودتحقیقات فراوان صورت گرفته ،مکانیسم هاي مولکولی دخیل در دگرگونی لنفوسیتهاي میزبان توسط شیزونت تیلریا هنوز به خوبی شناسایی نشده است.
- 13 - فرضیه پذیرفته شده در مورد نحوه ترانسفورم کردن لنفوسیتها توسط تیلریا چنین است که این عمل به صورت برگشت پذیر انجام می شود، به این معنا که حذف تک یاخته از سلول باعث خارج شدن سلول از حالت ترانسفورم شده گشته و در نتیجه سلول دیگر قادر به تکثیر نمی باشد 1 - و3و4و8و13و. - 15 اما در حین تحقیقات انجام شده در موسسه واکسن وسرم سازي رازي شیراز به منظور سازگار کردن سویه واکسینال تیلریا آنولاتا3 به دماي اتاق در یکی از فلاسکهاي کشت سلولی کلونیهاي سلولی متفاوتی پدیدار گردید که از نظر نحوه وخصوصیات رشد با سلول هاي اصلی تفاوت هاي زیادي داشت، بدین صورت که این رده هاي سلولی جدید فاقد شیزونت تیلریا آنولاتا بود. کار هاي تکمیلی انجام شده باعث به چالش کشیده شدن فرضیه از بین رفتن سلول پس از خروج تیلریا از آن گردید. براي اثبات فرضیه جدید نیاز به تکرار آزمایشات بالا و تولید رده هاي سلولی جدید از لنفوسیتهاي حاوي تیلریا بود که هدف اصلی از این پژوهش می باشد.
مواد وروش ها
رده هاي سلولی لنفوسیتی مورد استفاده:
-1 رده سلولی تیلریا آنولاتا - سویه واکسینال - از این سویه سال هاست جهت تولید واکسن تیلریا در موسسه رازي کرج استفاده میگردد.-2 رده سلولیK6 - تیلریا لستوکاردي - 4 از یک گاو مبتلا به تیلریوز در منطقه کازرون استان فارس جدا گردید. مشخصات این رده سلولی در بانک سلولی - - GenBank: GU233774.1 درج گردیده است. این رده سلولی اولین و تنها رده سلولی است که منشا آن لنفوسیت گاو است که توسط تیلریا لستوکاردي تک یاخته بیماریزاي گوسفند آلوده و ترانسفورم شده است. -3 رده سلولی کربال - - GenBank: 224090.1 ، از گاو مبتلا به تیلریا آنولاتا از منطقه کربال فارس جدا گردید نحوه ایجاد رده هاي سلولی جدید : در این پژوهش از سه رده سلولی حاوي تیلریا با روش هاي مختلف سه رده سلولی جدید بدون حضور تیلریا ایجاد گردید که تحت عنوان شیراز1-3 نام گذاري گردید.
الف -رده سلولی شیراز 1 :به منظور سازگار کردن سویه واکسینال تیلریا آنولاتا به دماي اتاق ، یکی از فلاسکهاي حاوي سلولهاي معلق در دماي اتاق و فلاسک دیگر در یخچال نگهداري شد پس ازیک هفته در اثر تغییرات دمایی بوجود آمده در فلاسک انکوبه شده در اتاق کلونی هایی تشکیل شد که از لحاظ ظاهري با لنفوسیت هاي حاوي تیلریا آنولاتا کاملا متفاوت بود، به این دلیل که این رده سلولی به صورت چسبنده تکثیر میشد . پس از آن با تغییر نحوه پاساژ بدین صورت که سلول هاي شناور همراه با محیط از فلاسک خارج شده وسلول هاي چسبنده باقی می ماندند،طی چند روز سلول هاي جدید به صورت تک لایه اي و یکنواخت کف فلاسک را پوشاندند. این رده سلولی طی پاساژهاي متوالی به رشد خود ادامه داد.
ب -رده سلولی شیراز .:2رده سلولی - K6 - همچنان که قبلا نیز مطرح شده بود، یک رده سلولی منحصر به فرد می باشد، در حین کار در آزمایشگاه درفلاسک حاوي پاساژ 10 آن ،دو نوع سلول با مورفولوژي مختلف مشاهده گردید، -1سلول هاي معلق،-2سلول هاي چسبنده .با تغییردر نحوه پاساژ سلول ها بجاي تکثیر سلول هاي معلق فرصت تکثیر را به سلول هاي چسبنده دادیم، این عمل تا زمانی که کف فلاسک از یک لایه یکنواخت از سلول هاي چسبنده پوشانده شود ادامه داده شدوچندین بار نیزپاساژ داده شد.
ج - جهت ایجادرده سلولی شیراز 3 با استفاده از کلیندامایسین - نوعی داروي ضد تک یاخته - با افزایش دوز - 0.5µl/ml به - 1µl/ml تیلریا حذف گردید بعد ازمدتی یک توده متراکم از سلول هاي چسبنده در کف فلاسک مشاهده گردید. در مرحله بعد تمام محیط رویی تخلیه گردید و سطح داخل فلاسک با محیط کشت شستشو داده شد و مجدداً محیط، سرم و آنتی بیوتیک اضافه و انکوبه گردید. به تدریج یک رده سلولی که به صورت چسبنده درآمده بود به تدریج لایه اي یکنواخت در کف فلاسک تشکیل داد. هر سه رده سلولی جدید شیراز تا 30 بارپاساژ داده شده وسپس با گلیسسرول در دماي -70 فریز گردیدند - شکل شماره - 1
آزمون هاي تعیین هویت سلولی:
-1تعیین سرعت رشدودوبرابرشدن سلول: رشد و بقاي این سلول ها پیش از فریزکردن و پس از بازیابی توسط تریپان بلو اندازه گیري شد ،شرایط مناسب رشد این رده هاي سلولی نیزاز نظر میزان سرم و نوع آن.و زمان دو برابر شدن این رده هاي سلولی طی فاز لگاریتمی با استفاده از آزمون MTT - طبق روش Freimoser.FM و همکاران - 1999 انجام شد.–2 تشخیص مولکولی تیلریا: بر اساس روش Gubbels, M.J, و همکاران 1999 و با استفاده از پرایمر هاي RLB-R2,RLB-F2 وجود تک یاخته تیلریا در سه رده سلولی اولیه و عدم حضور آن در رده هاي سلولی شیراز 3-1 بررسی گردید.همچنین از پرایمرهاي ALD1,ALD2 - پرایمر هاي مربوط به ژن هاي آنزیم آلدولاز - و پرایمرهاي اختصاصی VAC2 وVAC1 جهت تعیین هویت سلول و شناسایی منشا آن استفاده گردید 1 - و10و– 3. - 12 تعیین کاریوتیپ سلولی :شمارش کروموزوم هاي سلول - کاریوتایپینگ - بر اساس روش Weng BH وهمکاران2007 و. Hong 2004Changانجام شد. - جدول شماره - 1
