بخشی از مقاله
چکیده
سرطان پروستات شایع ترین سرطان موجود در مردان میباشد. استفاده از آنتیبادي در درمانهاي انتخابی سرطان بسیار مورد توجه است. مهمترین فاکتور در درمان یا تشخیص، یافتن آنتیژن هاي اختصاصی سرطان میباشد. آنتیژن PSMA با توجه به افزایش آن در سرطان پروستات، گزینه مناسبی جهت آنتیبادي درمانی می باشد. نوع خاصی از آنتیبادي هاي شتري که VHH نام دارد، با توجه به کوچکی اندازه، داراي مزایاي بسیار زیادي در کاربردهاي کلینیکی میباشد. پس از تهیه کتابخانههاي فاژي حاوي نانوبادي توسط تکنیک نمایش فاژي و غربالگري آنها، نانوبادي اختصاصی با افینیتی بالا بر علیه آنتیژن مورد نظر به دست میآید.
هدف، هدف از این مطالعه طراحی و تولید یک اپیتوپ از آنتیژن PSMA و تهیه کتابخانه فاژي حاوي نانوباديهاي شتري، بر علیه این آنتیژن میباشد.روش، آنتیژن PSMA پس از کلون و بیان، به شتر تزریق شد. پس از تخلیص لنفوسیت هاي شتري و جداسازي RNA، cDNA ساخته شد. با انجام دو واکنش PCR متوالی، ژنهاي VHH جدا گردید. ژنهاي نانوبادي وارد وکتور فاژمیدي شد و پس از قرار دادن در میزبان مناسب، توسط فاژ کمکی آلوده گردید. بدین ترتیب کتابخانه فاژي حاوي نانوبادي ایجاد شد. این کتابخانه جهت به دست آوردن نانوبادي با افینیتی بالا، 5 مرحله غربالگري شد.
نتیجه، بیان آنتیژن PSMA توسط الکتروفورز و وسترن بلات، و ایمن شدن شترها توسط الایزا تایید شد. تکثیر ژنهاي VHH توسط الکتروفورز تایید شد. همچنین تایید کتابخانه ژنی توسط واکنش کلونی PCR انجام شد. وجود فاژهاي نمایش دهنده نانوبادي نیز توسط الایزا بر علیه PSMA به تایید رسید.
کلمات کلیدي: نانو بادي شتري، سرطان پروستات، نمایش فاژي، آنتی ژن .PSMA
مقدمه
سرطان پروستات معمول ترین سرطان مشاهده شده در مردان بوده و دومین علت مرگ هاي ناشی از سرطان بعد از سرطان ریه می باشد 5 - ، 4 و. - 9 علاوه بر واکسیناسیون و ژن درمانی، استفاده از ایمونوتوکسین یا درمان توسط آنتیبادي نیز یک راه جدید در درمان سرطان میباشد . آنتیبادي ها گلیکو پروتئین هایی هستند، که به صورت اختصاصی و با افینیتی بالا به آنتی ژن هاي خود متصل شده و موجب تخریب انتخابی سلول هاي سرطانی میشوند.
در این روش، بر خلاف درمان هاي مرسوم، آسیبی به سلول هاي سالم وارد نشده و اثرات جانبی کمتري در پی خواهد داشت تا کنون چندین آنتی بادي با کاربرد درمانی براي سرطان پروستات تولید شده اند که ازآن جمله می توان به آنتی بادي J591, J415 , J533 7E11 و E99اشاره کرد . آنتی ژن اختصاصی غشایی پروستات ، گلیکو پروتئینی با وزن 100 کیلودالتون می باشد . این پروتئین 750 اسید آمینه اي که در غلظت بالا در سطح سلولهاي اپیتلیالی پروستات بیان میشود.
به عنوان یک هدف مناسب جهت ایمونوتراپی مورد توجه قرار گرفته است HCAb . - 4 - کلاس جدیدي از آنتی بادي هاي IgG می باشد که در خانواده شتر یافت شده و فاقد زنجیره هاي سبک می باشند دومن هاي متغیر این آنتی بادي ها ، کوچکترین قطعاتی - حدود 120 اسید آمینه - هستند که به طور طبیعی به آنتیژن متصل میشود. این قطعات نانو بادي نام دارد نانو بادي ها به دلیل دارا بودن پایداري بالا در گرما، نفوذ سریع به بافت ها، پاك شدن سریع از خون و کلیه، شناسایی اپی توپ هاي جدید، اختصاصیت و افینیتی بالا، تولید در مقیاس زیاد و حلالیت مناسب، توجه محققین را در سالهاي اخیر به خود جلب نموده است.
براي جدا سازي آنتی بادي هاي با ویژگی هاي مورد نظر، با استفاده از آنتی ژن هاي خالص، کتابخانه فاژي حاوي نانو بادي غربالگري می شود 9 - وDNA . - 6 کد کننده میلیون ها لیگاند مختلف از جمله آنتی بادي ها را می توان به عنوان فیوژن یکی از پروتئین هاي پوششی فاژ هاي رشته اي، در سطح فاژ نمایش داد .در این مطالعه از فاژمید pCOM3X به عنوان حامل استفاده شد . در نهایت توسط فاژ کمکی M13، نانو بادي هاي مربوطه، همراه با پروتئین پوششی در سطح فاژ به نمایش در آمدند در این مطالعه با استفاده از ابزارهاي بیوانفورماتیکی بخشی از آنتی ژن PSMA به عنوان اپی توپ انتخاب شد. کتابخانه فاژي حاوي نانو بادي هاي اختصاصی بر علیه آنتی ژن نوترکیب ساخته شد. و در نهایت توسط روش هاي غربالگري، کتابخانه فاژي با افینیتی بالا به دست آمد.
مواد و روشها
براي تولید آنتی ژن، با استفاده از نرم افزارهاي بیوانفورماتیکی قسمتی از آنتی ژن PSMA انتخاب و پس از بهینه سازي با کدون بیاس E.coli، به صورت صناعی سنتز و در وکتور pET28a کلون و در E.coli بیان گردید. براي ایمن نمودن شتر آنتی ژن نوترکیب بعد از خالص سازي، در پنج مرحله و در فواصل 10 روزه، به شتر تزریق شد. جهت بررسی تیتر آنتی بادي در خون شتر، واکنش الایزا با استفاده از آنتی ژن نوترکیب انجام شد.
در ادامه وکتور فاژمیدي و ژنهاي VHH، توسط آنزیم sfiI برش داد ه شد و واکنش اتصال توسط آنزیم T4 Ligas انجام شد. محصول واکنش لیگاسیون به سلولهاي مستعد E.coli TG1 منتقل شد جهت تایید کلون هاي به دست آمده از تکنیک کلونی PCR استفاده شد. باکتري هاي مورد نظر در 0.6 OD توسط فاژ کمکی M13 آلوده شدند. در ادامه به کشت مورد نظر کانامایسین با غلظت 50 µg/ml اضافه و به مدت 16 ساعت در دماي 37 درجه سلسیوس انکوبه شد.
به محلول فاژي به دست آمده PEG 6000 اضافه و به مدت یک ساعت در یخ انکوبه شد. فاژها توسط سانتریفوژ - دور 15000 و زمان 25 دقیقه - جمع آوري شدند. براي غربالگري جهت به دست آوردن کتابخانه فاژي حاوي نانو بادي با اافینیتی بالا 5 مرحله panning انجام شد. بدین ترتیب که پلیت الیزا توسط آنتی ژن با غلظت 10 µg/ml پوشانده شد و محلول فاژي به مدت یک ساعت بر روي آن انکوبه گردید. محلول فاژي خارج و چاهک ها توسط PBS حاوي tween 20 با غلظت 0.1 در صد، 10 بار شسته شد. فاژهاي داراي نانو بادي با افینیتی بالا توسط اسید از ته چاهک کنده شد.
