بخشی از مقاله
بررسي توليد کاروتنوئيد توسط باکتري Halorubrum chaoviator sp. TBZ126 جدا شده از شمال غرب ايران
چکيده :
هدف : کاروتنوئيد ها به دليل گستردگي زياد، عملکرد هاي گوناگون و خواص جالب توجه آنها، مورد توجه در بسياري از زمينه هاي مختلف علمي ميباشند. هدف از اين مطالعه بررسي توليد کاروتنوييد توسط ايزوله باکتريايي جدا شده از درياچه اروميه در جهت معرفي هر چه بيشتر پتانسيل هاي اين درياچه استراتژيک و معرفي منبع جديدي براي توليد کاروتنوئيدها مي باشد.
روش : کاروتنوئيدهاي توليدي باکتري Halorubrum chaoviator sp. TBZ126 جدا شده از درياچه اروميه توسط حلال استون .متانول استخراج گرديد. پس از غربالگري اوليه کاروتنوييدها با استفاده از روش اسپکتروسکوپي، تکنيک LC-MS براي جداسازي و تشخيص نوع کاروتنوييدهاي استخراجي به کار گرفته شد. تستهاي بيوشيميايي و ژنتيکي و آناليز نتايج تواليیابي s rRNA١٦ به منظور شناسايي ايزوله باکتريايي انجام شد.
نتيجه : سه نوع کاروتنوييد باکتريوروبرين ، ليکوپن و بتاکاروتن مورد شناسايي قرار گرفت . بر اساس آناليز توالييابي s16 rRNA ايزوله مورد نظر بيشترين تشابه (٩٩٪) را با Halorubrum chaoviator نشان داد.
کلمات کليدي : کاروتنوئيد، باکتريوروبرين ، ليکوپن ، بتاکاروتن
مقدمه :
کاروتنوئيد ها رنگدانه هايي از زرد تا نارنجي متمايل به قرمز هستند که در طيف وسيعي از قارچها، باکتري ها، جلبکها و گياهان وجود دارند. کاروتنوئيد ها رنگدانه هاي زيستي تتراترپنوئيدي هستند که به صورت طبيعي در کلروپلاست و کروموپلاستهاي گیاهان و بعضي ديگر از ميکروارگانيسم ها مثل جلبکها و بعضي از گونه هاي قارچی وباکتري ها تولید می شوند [١]. مطالعه بر روي تولید کاروتنوئيد ها از باکتري هاي نمک دوستیک رويکرد براي بدست آوردن منبع تجاري جايگزين کاروتنوئيد خواهد بود. میکروارگانیسم هاي نمک دوست و مقاوم به نمک توانايي زنده ماندن در محیط هاي نمکی را دارند[٢]، که پیشنهاد شده است که کاربردهاي بالفعل وبالقوه زايدي در بسیاری از زمینه هاي بیوتکنولوژي را دارند[٣]. در نتیجه سازگار شدن میکروارگانیسم ها به اين محیط هاي افراطی ويژگی هاي منحصر به فردي در زمینه بیوتکنولوژي از خود نشان میدهند و در نتیجه داراي اهمیت اقتصادي هستند. مشخصا آنها از دو استراتژي براي مقابله با محیط هاي نمکی استفاده میکنند . آرکئاهاي نمک دوست تعادل اسمزي سیتوپلاسم خود را با محیط هاي پرنمک بوسیله تجمع غلظتهاي بالاي نمک حفظ میکنند . اين مکانیسم تنظیم اسمزي ، نیاز به سازگاري ويژه اي از آنزيم هاي داخل سلولی دارد که در محیط هاي نمکی کاربرد دارند. در مقابلی و باکترهاي نمک دوست اي مقاوم به نمک بوسیله وجود مسیرهاي زايد و متنوع متابولیکي مشخص می شوند. غلظت نمک داخل سلولی اينها پايين است و تعادل اسمزي سیتوپلاسم خود را با محیط بیرون بوسیله تجمع غلظت هاي زايدي از محلول هاي اسمزي آلی گوناگون حفظ می کنند. آنزيم هاي داخل سلولی اينها مقاومت ويژه اي به نمک ندارند .[3]
بيشتر آرکئاهاي نمک دوست در خانواده هالو باکترياسه داراي رنگ نارنجي قرمز روشن که به علت وجود مقدار زيادي از غشاي قرمز متشکل از رنگدانه هاي کاروتنوئيد ميباشد. درياچه هاي خيلي شور و تالاب هاي محتوي نمک کريستالي شده نزديک به اشباع ، به طور کلي داراي رنگ قرمز هستند که به دليل حضور کاروتنوئيد هاي آرکئيايي است [٤]. بيشتر کاروتنوئيدهاي آرکئاهاي نمک دوست کاروتنوئيدهاي ٥٠ کربنه (C٥٠) هستند که بيشتر باکتريوروبرين و مشتقات آن شامل مونوآنهيدروباکتريوروبرين و بيس آنهيدروباکتريوروبرين ميباشد [٥ [. رنگدانه هاي باکتريوروبرين از هالوباکتريوم و موارد ديگر از هالوباکترياسه ، در برابر آسيب نور با شدت بالا در محدوده قابل رويت و تابشهاي در محدوده فرابنفش محافظت مي کند و غشاي سلولي را تقويت ميکند. موتانتهاي سفيد رنگ بدون باکتريوروبرين را به راحتي ميتوان از ديگر گونه ها مانند Halobacterium salinarum جدا کرد [٦]. باکتريوروبرين (آنهايي که داراي ١٣ پيوند دوگانه پيوسته هستند) راديکال هاي هيدروکسيل را بسيار موثرتر از بتاکاروتن (آنهايي که محتوي ١١ پيوند دوگانه پيوسته هستند) پاکسازي ميکند. بنابراين پيوندهاي دوگانه پيوسته زياد باکتريوروبرين ، به عنوان محافظ اکسيداني موثري عمل مي کنند. علاوه بر اين نشان داده شده است که باکتريوروبرين باعث مقاومت در برابر عوامل اکسيداتيو آسيب به DNA، مثل پرتوهايیونيزه کننده و پراکسيد هيدروژن در شرايط زنده مي شود [٧].
با مصرف مواد غذايي غني از کاروتنوئيد مثل ميوه ها و سبزيجات به بسياري از سرطانها، بيماريهاي قلبي -عروقي، بيماريهاي چشمي وغيره کمتر دچار مي شوند [٨]. همچنین با افزايش گزارشات در مورد تاثیر مفید بر روي سلامتی، بازار رو به رشد آن خواستار پروسه تولید مقرون به صرفه و با منشا زيستي و کاربرد میکروارگانیسم هاي مهندسی شده بجاي تولید شیم اييي آن است [٩].
مواد و روشها: کشت
باکتري نمک دوست جدا شده از درياچه اروميه در محيط کشت Marine Agar با ٢٥% نمک تلقيح و در شرايط مناسب انکوبه گرديد ( دما C°٣٠). بعد از ٧ روز باکتري هاي رشد کرده و کلني هاي قرمز رنگي بر روي پليت کشت شده ايجاد کردند. سپس تک کلني ها به محيط کشت Marine broth با ٢٥% نمک و در ارلن مايرهاي ٢٥٠ ميلي ليتري که محتوي ١٠٠ ميلي ليتر محيط کشت بودند منتقل گرديد. محيط کشت مايع در شرايط مناسب ( دما C °30، 7.5= pH، انجام شيک برابر ١٢٠ دور در دقيقه ، داراي نور) انکوبه گرديد. بعد از ٧ روز باکتري ها رشد کرده و محيط کشت مايع کاملا قرمز رنگ شدند. ميزان رشد باکتري ها با استفاده از ميزان جذب طيف هاي نور ( OD) اندازه گيري گرديد و باکتري ها در اواخر مرحله رشد هندسي استخراج گرديدند.
استخراج کاروتنوئيدها
محيط کشت محتوي باکتري ها در ٢ فالکون ٥٠ ميلي ليتري تقسيم گرديد و در دور g ٥٠٠٠ در دماي C°٤ به مدت ١٠ دقيقه سانتريفيوژ گرديد. مايع رويي دور ريخته شد و به رسوب قرمز رنگ محتوي باکتري، به هر کدام از فالکون ها ٢ ميلي ليتر حلال استون ريخته شد و عمل سانتريفيوژ با دور g ١٠٠٠٠ در دماي C° ٤ به مدت ٢٠ دقيقه انجام گرفت . مايع رويي (استون محتوي کاروتنوئيدها) جمع آوري گرديد و اين عمل ٣ مرتبه انجام پذيرفت تا رسوب باکتري کاملا بي رنگ گرديد و رنگدانه هاي آن کاملا خارج گرديد.
