بخشی از مقاله
چکیده
ویروسهاي عامل زردي در حبوبات از جمله ویروس زردي بافت مردهي باقلا - Faba bean necrotic yellows virus, - FBNYV از ویروسهاي خسارتزا در حبوبات میباشند. جهت ردیابی مولکولی این ویروس از مزارع حبوبات و یونجه در استانهاي فارس، زنجان، گلستان، خوزستان و کهگیلویه و بویر احمد بازدید و نمونه برداري شد. FBNYV در گیاهان باقلا، یونجه، عدس، نخود و لوبیا عمدتاً با علائم زردي تشخیص داده شدهو در مورد نمونههاي انتخابی مراحل استخراج دي ان اي ویروس، تکثیر ژن کدکنندهي پروتئین پوششی با آغازگرهاي اختصاصی، همسانهسازي و تعیین ترادف به عمل آمد.
میزان شباهت نوکلئوتیدي و آمینواسیدي بخشی از ژن کدکنندهي پروتئین پوششی جدایههاي ایرانیFBNYV با جدایههاي موجود در بانکژن به ترتیب %92/5 - 99/1 و %97/3 - 100 تعیین شد. این شباهتها میتواند نشان دهندهي پایستگی در ژن پروتئین پوششی در ویروس مورد بررسی باشد. تنوع در ژن پروتئین پوششی نسبت به ژن حفاظت شدهي پروتئین همراه با همانندسازي - Rep - بیشتر است که تأییدکنندهي نتایج قبلی است.
مقدمه
ویروس زردي بافت مردهي باقلا1 ویروسی است که شیوع آن در مزارع حبوبات معمول بوده و به عنوان عامل کاهش محصول در چندین لگوم غذایی و علوفهاي به خصوص باقلا، گزارش شده است 3 - ، 4 و . - 10 این ویروس اولین بار در سال 1988 از سوریه و متعاقب آن در بسیاري از کشورهاي غرب آسیا و شمال آفریقا، کشورهاي شرق و جنوب مدیترانه - 7 - و همچنین از ایران گزارش شده است . - 5 - این ویروس متعلق به تیره Nanoviridae است که اعضاي این تیره داراي ژنوم ssDNA حلقوي بوده، محدود به بافت آبکشی گیاه میزبان خود هستند، با شته به طریق پایا منتقل می شوند، ولی انتقال به صورت مکانیکی یا از طریق بذر ندارند 10 - و . - 7 FBNYV داراي ژنوم یازده تا دوازده بخشی با اندازهي نسبتاً مشابه است که هر کدام به صورت انفرادي به همراه یک پروتئین پوششی کپسیدپوشی میشود .
- 4 - انتقال این ویروس در شرایط طبیعی به وسیله سه گونه شته شامل Acyrthosiphon pisum، Aphis craccivora و A. fabae صورت می گیرد 4 - و . - 3 دامنهي میزبانی FBNYVعمدتاً محدود به گیاهان تیرهي Fabaceae میشود و میزبانهاي مهم آن شامل نخود، باقلا، نخودفرنگی، عدس، شبدر، یونجه، لوبیا، لوبیا چشم بلبلی و علفهاي هرز این تیره هستند 7 - و . - 6 مطالعات انجام شده در مورد FBNYV در ایران بیشتر مبتنی بر آزمونهاي سرولوژیکی و الکترون میکروسکوپی بوده است. در این مطالعه تنوع مولکولی این ویروس در مزارع حبوبات استان فارس، استانهاي همجوار و چند استان شمال و شمال غرب کشور مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها
جهت ردیابی FBNYV از مزارع مختلف حبوبات در استانهاي فارس، زنجان، خوزستان، گلستان و کهگیلویه و بویراحمد طی سالهاي 86-89 بازدید به عمل آمد و از گیاهان داراي علائم زردي، کوتولگی و پیچیدگی نمونهبرداري شد. جهت استخراج دي ان اي ویروس از محلول - 1 - CTAB2 استفاده شد. از دي ان اي استخراج شده در واکنش زنجیره اي پلیمراز - PCR - بعنوان دي ان اي الگو استفاده شد و با کاربرد آغازگرهاي اختصاصی با ترادفهاي 5 -TTATTGTTAAATGTAAT TCACCTAT-3 و 5 -CACTTCAACATAAACTCTG-3 نسبت به تکثیر قطعهاي به اندازهي حدود 270 جفت باز از قطعهي پنجم - C5 - ویروس که مربوط به ژن پروتئین پوششی است اقدام شد .
- 7 - برنامه دمایی مورد استفاده شامل یک مرحله دماي 94°C به مدت 5 دقیقه، 35 چرخه 94°C به مدت 30 ثانیه، 49°C به مدت 45 ثانیه و 72°C به مدت یک دقیقه و در پایان یک چرخه 72°C به مدت 10 دقیقه بود. در نهایت محصول PCR به دست آمده، در ژل آگاروز % 1 الکتروفورز گردید. پس از خالص سازي دي ان اي تکثیر شده از ژل با استفاده ازQiagen Gel Extraction kit، اتصال دي ان اي خالص شده به ناقل پلاسمیدي pTZ57R/T به منظور ساخت پلاسمید نوترکیب و انتقال پلاسمید نوترکیب به سلولهاي مستعد سویهي XLBlue باکتري E. coli با استفاده از Ins T/A clone PCR product cloning kit - Fermentas - طبق دستورالعمل شرکت سازنده انجام شد.
سپس پرگنههاي سفید رنگ جهت تکثیر باکتري حاوي پلاسمید نوترکیب انتخاب و استخراج پلاسمیدهاي نوترکیب با استفاده از روش جوشاندن - 2 - 3 انجام گردید. پس از ارزیابی همسانه ها از راه هضم آنزیمی، همسانه هاي حاوي قطعه مورد نظر جهت تعیین ترادف نوکلئوتیدي به شرکت Tech Dragon کشور هنگکنگ ارسال گردید. ترادفهاي به دست آمده مربوط به ژن پروتئین پوششی FBNYV ، با ترادف هاي موجود در پایگاه اطلاعاتی NCBI توسط برنامه BLAST مقایسه شد و پس از تأیید صحت آنها، با استفاده از نرمافزارهاي - Biosoft Version 9.02 - DNAMAN، - 9 - Clustal X و MEGA4 - 8 - همردیفسازي ترادف نوکلئوتیدي و آمینواسیدي جدایههاي ایرانی انجام شد، این ترادفها با یکدیگر و با ترادف نوکلئوتیدي جدایههاي موجود در GenBank مورد مقایسه قرار گرفت و درخت فیلوژنتیکی مربوطه ترسیم شد و مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.
نتایج و بحث
نتایج به دست آمده نشان داد که آلودگی به ویروس زردي بافت مردهي باقلا در مزارع حبوبات در استانهاي مورد بررسی شامل مزارع باقلاي استانهاي خوزستان، گلستان، فارس، زنجان و مزارع یونجه و لوبیاي فارس و زنجان و مزارع عدس زنجان وجود دارد. به این ترتیب این اولین گزارش از آلودگی مزارع حبوبات در استانهاي فوقالذکر به ویروس مورد بررسی است. شکل شماره یک نتایج حاصل از آزمون PCR را در تعدادي از نمونههاي مورد مطالعه نشان میدهد. با توجه به اینکه در تمام مناطق مورد بررسی آلودگی باقلا به FBNYV مشاهده شد، میتوان این گیاه را میزبان مناسبی براي ویروس در نظر گرفته و در مناطق کشت این محصول امکان بروز و خسارت زایی این ویروس و اثر آن در کاهش کمیت و کیفیت محصول را مورد توجه قرار داد.
شکل -1 نقوش الکتروفورزي محصول PCR تکثیر شده با آغازگرهاي اختصاصی FBNYV مربوط به بخشی از ژنC5 ویروس از نمونههاي گیاهی مناطق مورد بررسی. راهکهاي 1-4 نمونههاي لوبیاي اقلید، راهکهاي 5 -11 نمونههاي باقلاي گلستان و مازندران، راهکهاي 12-14 نمونههاي باقلاي کازرون، راهک هاي 15و 16 به ترتیب نمونهي گیاه سالم و آب به عنوان کنترل منفی، راهک 17 نمونه یونجهي شیراز. : M مارکر . - 100bp - مقایسه ترادف بخشی از قطعهي شمارهي پنج ژنوم FBNYV جدایههاي ایرانی نشان داد که نمونههاي به دست آمده از مناطق مختلف ایران در ترادف نوکلئوتیدي قسمت مورد بررسی %100 با هم شباهت دارند.
در مقایسه ترادف همین قسمت با جدایههاي موجود در بانکژن مشخص شد که میزان شباهت جدایههاي ایرانی با جدایههاي غیر ایرانی در سطح نوکلئوتیدي %92/5 - 99/1 است. بیشترین شباهت با جدایهي آذربایجان و کمترین شباهت با جدایههاي مصر و سوریه بود - جدول . - 1 در سطح آمینواسیدي میزان شباهت این قسمت از ژنوم FBNYV جدایههاي ایرانی با جدایههاي موجود در بانکژن - 100 %97/3 تعیین شد - دادهها نشان داده نشده است - . بر این اساس، ترادف آمینواسیدي قطعهي مورد مطالعه در تمام جدایههاي ایرانی با جدایههاي آذربایجان، اسپانیا و مراکش یکی بود در حالیکه با جدایههاي مصر و سوریه اختلاف داشت.
