بخشی از مقاله
چکیده
آنتی اکسیدان ها ، مولکول هایی با توانایی مهار اکسیداسیون مولکول های دیگر هستند که دارای کاربردهای دارویی و صنعتی می باشندو عموماً در جلبک ها یافت می شوند. تحقیقات نشان داده است که با توجه به اثرات مضر آنتی اکسیدان های سنتتیک، جایگزینی آنها با آنتی اکسیدان های طبیعی بسیارمفید خواهد بود. بنابراین هدف از تحقیق حاضر، ارزیابی فعالیت آنتی اکسیدانی سیانوباکترهای جدا شده از رودخانه کر می باشد. بدین منظور18 نمونه از عمق 20 سانتی متری مناطق مختلف رودخانه کر جمع آوری گردید. پس از رقیق سازی، نمونه ها ابتدا در محیط BG11 جامد و پس از گذشت 3 هفته و رشد در شرایط نور و تاریکی در جعبه خاص کشت و در دمای اتاق تحت کشت هایی در محیط BG11 مایع نگهداری شدند.
پس از 3 هفته، کلنی ها با شناسایی میکروسکوپیک و مولکولی توسط پرایمرهای خاص برای ژن 16S rRNA مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند و توانایی تولید ترکیبات آنتی اکسیدانی آنها به کمک دو روش DPPH و FRAP مورد ارزیابی قرار گرفت. علاوه بر این به کمک FTIR آنالیز ترکیب مورد بررسی قرار گرفت. در مجموع چهار جنس سیانوباکتریایی شامل: Cyanobacterium sp. KSU-AQIQ-3 Synechocystis aquatilis، Geminocystis، Cyanobacterium stanieri از رودخانه کر جداسازی گردید که گونه Cyanobacterium stanieri فعالیت آنتی اکسیدانی بالاتری را از خود نشان داد. همچنین در طیف سنجی FTIR، Cyanobacterium stanieri ترکیباتی حاوی گروه هیدروکسیل - - -OH، گروه C-H ، باندهای C & و C N و گروه کربونیل - - -CO می باشد کهاحتمالاً مسئول مهار فعالیت آنتی اکسیدانی ارگانیسم است. بنابراین می توان نتیجه گرفت که Cyanobacterium stanieri می تواند منبع خوبی برای مواد غذایی، دارویی و دیگر کاربردهای صنعتی باشد.
کلمات کلیدی: آنتی اکسیدان، سیانوباکتری، FRAP، FTIR
مقدمه
سیانو باکتریها، با سیستم فتوسنتزی دی اکسید کربن را به شکل احیا تبدیل مینمایند و ماشین بیوسنتزی ایدهآلی برای تولید پایدار مواد شیمیایی و سوختهای زیستی مختلف به حساب میآیند. بر خلاف باکتریهای هتروتروف، سیانو باکتریها نیاز به نور خورشید، دی اکسید کربن، آب، و حداقل مواد مغذی برای رشد دارند، که موجب از بین بردن هزینههای تأمین منابع کربن و محیطهای رشد پیچده میگردد، که منشأ تکاملی آنها به حدود 2/6-3/5 میلیارد سال پیش باز می گردد - Hedeges et al., 2001 - . این ارگانیسمها در شرایط تاریکی و یا بدون اکسیژن، می توانند برای تولید انرژی عمل تخمیر انجام دهند و در برخی از سیانو باکتریهای رشتهای سلولهای تخصصی شناخته شدهای به نام هتروسیست برای انجام تثبیت نیتروژن تکامل یافته است . - Capone et al., 2005 - با توجه به مزیت ذاتی سیانو باکتریها، آنها یکی از نامزدهای جذاب مورداستفاده در برنامههای مختلف بیوتکنولوژی محسوب میشوند.
با پیشرفت فنآوری ژنتیک و متابولیسم و در دسترس بودن بیش از 300 توالی ژنومی سیانو باکتر، پیشرفتهای قابل توجهی در تحقیقات در جهت تحقق پتانسیل این باکتریهای فتوسنتزی ایجاد شده است. بر همین اساس در سراسر جهان تلاش های فراوانی جهت یافتن منابع طبیعی آنتی اکسیدان به منظور جلوگیری از آسیب اکسیداتیو به سلول های زنده صورت پذیرفته است. به طور سنتی، برخی از آنتی اکسیدان ها مانند چای، میوه ها، سبزیجات و ادویه جات ار دیرباز مورد استفاده قرار گرفته اند. همان گونه که ذکر شد سیانو باکتری ها ارگانیسم های پروکاریوتی شامل طیف گسترده ای از رنگدانه های آنتی اکسیدانی می باشند - Krishnaraj et al., 2012 - بطوریکه باور بر این است که سیانو باکتریها سرشار از آنتی اکسیدان ها و فیکوبیلی پروتئینها میباشند . - Matta et al ., 2010 - بنابراین تحقیق حاضر بدنبال جداسازی سیانوباکترها از رودخانه کر با توانایی تولیدآنتی اکسیدانها می باشد.
مواد و روشها
در تحقیق حاضر از 3 ایستگاه رودخانه کر شامل: ایستگاه پل راه آهن، اسفندران و پل خان طی ماههای خرداد- تیر 95 در بازه زمانی 9:30 -11 ، 18 نمونه جمع آوری گردید و نقاط جغرافیایی هر ایستگاه به کمک دستگاه GPS ثبت گردید. نمونه ها پس از رقیق سازی متوالی به محیط کشت BG11 منتقل گردید و پلیت ها در اتاقک رشد با شدت نوری 2000-1500 لوکس ، 12 ساعت نور و 12 ساعت تاریکی و دمای 28 2 قرار داده شدند پس از گذشت 3 هفته کلنی های سبز رنگ در سطح پلیت مشاهده گردید و از نمونه های سیانوباکتریایی خالص شده، لام تهیه گردید و با استفاده از میکروسکوپ نوری مورد ارزیابی قرار گرفتند . - Foster et al ., 2009 - جهت بررسی های مولکولی و شناسایی جدایه ها بر اساس ژن S rRNA 16 نمونه سیانوباکتری آنابنا با کد IBRC-M5002 به عنوان سویه استاندارد که توانایی تولید آنتی اکسیدان و سم میکروسیستین دارا می باشد از مرکز ذخایر ژنتیکی ایران تهیه گردید و به عنوان کنترل مثبت برای ارزیابی مولکولی مورد استفاده قرار گرفت.
پس از استخراج DNA به کمک کیت یکتا تجهیز ایران، واکنش زنجیره ای پلی مراز به کمک پرایمرهای اختصاصی ارائه شده در جدول و بازه زمانی برای انجام این آزمون صورت گرفت - زرینی و همکاران،. - 1390زیست توده جلبکی توسط سانتریفوژ کشت های مایع در 3000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه در دمای 27 درجه سانتی گراد انجام شد. مایع رویی جداسازی و پلیت های سلولی پس از شست و شو توسط آب مقطر استریل سانتریفیوژ شدند، این عمل دوبار صورت پذیرفت، سپس مواد ته نشین شده به پلیت های شیشه ای انتقال یافتند و تبخیر محیط کشت به منظور برداشت زیست توده در 55 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت در آون صورت پذیرفت - Hossain et al., 2016 - و زیست توده خشک در دمای 4 درجه سانتی گراد برای مراحل بعدی آزمون نگه داری شد.
به منظور تهیه عصاره سلولی به زیست توده خشک 2 میلی لیتر اتانول مطلق افزوده گردید و حل شدن کامل حلال توسط ورتکس به مدت 5 دقیقه صورت پذرفت. پس از گذشت 20 دقیقه، محلول حاصل به مدت 15 دقیقه در حمام اولتراسونیک 250 هرتز قرار گرفت و بعد از تخریب سلول، هر گونه مواد نامحلول از عصاره توسط سانتریفوژ با 2000 دور در دقیقه در 27 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه حذف شد و مایع رویی برای حضور آنتی اکسیدان، مورد تجزیه و تحلیل جدا گردید . - Henriques et al., 2007 - توانایی تولید آنتی اکسیدان درجدایه ها به دو روش DPPH وFRAP انجام گردید. فعالیت بدام انداختن نمونه های مختلف عاری از سلول از پیش گرم شده ی عصاره چهار سیانو باکتر بر فعالیت مهار محلول DPPH با توجه به روش هو و همکاران با اندکی تغییر ارزیابی شد . - Hou et al., 2001 - غلظت DPPH به عنوان 0/06 میلی گرم / میلی لیتر در متانول آماده شد.
سپس 60 میکرولیتر از نمونه عصاره عاری از سلول و 90 میکرولیتر آب مقطر به دنبال آن100 میکرولیتر محلولDPPH اضافه شد. ترکیبات به مدت 30 دقیقه در شرایط تاریکی قرار گرفت و جذب در طول موج 517 نانومتر تعیین گردید. اسکوربیک اسید نیز به عنوان استاندارد در این مرحله مورد استفاده قرار گرفت و یک منحنی استاندارد آن طراحی شد. سنجش قدرت آنتی اکسیدانی احیا فریک - FRAP - با توجه به روش بنزی و استرین - Benzie and Strain, 1999 - ، با برخی اصلاحات انجام شد.در pH پایین، احیا کمپلکس tripyridyltriazine فریک به فرم آهنی، رنگ آبی تیره تولید می نماید که می توان با اندازه گیری جذب در 593 نانومتر ارزیابی نمود.
بر همین اساس مقدار 0/17 گرم عصاره عاری از سلول در 4 میلی لیتر متانول حل شد. سپس محلول کار FRAP تهیه گردید. بدین منظور 10 میلی لیتر بافر استات pH3.6 - ، - 300mmol/l با 1 میلی لیتر از ماده TPTZ1 محلول در اسید کلریدریک - 40mmol/l - مخلوط شد، پس از آن 1 میلی لیتر محلول کلرید فریک - 20 mmol/l - اضافه گردید. پس از تهیه محلول کار، 1/5 میلی لیتر از محلول فوق در کوت در بن ماری به دمای 37 درجه سانتی گراد رسانده شد و جذب آن در طول موج 593 اندازه گیری شد. سپس میزان 10 میکرولیتر از نمونه سیانوباکتری به کوت افزوده و جذب پس از 4 دقیقه انکوباسیون در طول موج 593 اندازه گیری شد. منحنی کالیبراسیون با استفاده از یک محلول آبی از سولفات آهن FeSO4.7H2O تهیه شد.
در نهایت با استفاده از طیف سنجیFTIR ، برای تعیین طول موجهای مختلف نور پیوندهای شیمیایی استفاده گردید به طوریکه این دستگاه برای هر ماده ای طول موج متفاوتی را ارائه می دهد.به منظور آماده سازی نمونه، مقدار معینی از زیست توده خشک 1 - میلی گرم - به هاون چینی منتقل شد. پودر خشک به طور کامل با 2 میلی گرم پتاسیم برمید خشک توسط دسته هاون مخلوط گردید. پودر حاصل توسط دستگاه پرس، به مدت 30 ثانیه تحت فشار قرار گرفت و در نهایت نمونه به پلت فشرده شده تبدیل گردید. پلت حاصل در دستگاه FTIR اسپکترومتر قرار گرفت و طیف سنجی در دامنه ی مادون قرمز میانه - 4000-500 cm 1 - و در دمای اتاق - 26 C-1 - ثبت گردید - D,Souza et al., 2008 - .
