بخشی از مقاله
چکیده
عفونت مجاري ادراري یکی ازشایع ترین مشکلات بالینی در دنیا محسوب می شود .علی رغم درمان توسط آنتی بیوتیک هاي متنوع ،هم چنان شیوع عفونت و خطر مقاوم شدن باکتري ها در طی درمان نسبت به آنتی بیوتیک ها وجود دارد.جایگاه گیاهان دارویی در طب سنتی کشور ما و منابع غنی گیاهی در دسترس ازیک سو و مشکلات موجود در درمان عفونت هاي ناشی از سویه هاي مقاوم میکروبی ازسوي دیگر عاملی براي بررسی دقیق تر داروهاي گیاهی بوده است.این تحقیق به منظور بررسی اثر ضد باکتریایی عصاره اتانولی و آبی 4 گونه از گیاهان دارویی استان ا یلام علیه باکتري هاي مولد عفونت مجاري ادراري انجام شده است.گونه ها از زیستگاه هاي طبیعی خود واقع دراستان ایلام جمع آوري و پس از خشک شدن، عصاره اتانولی و آبی آن ها تهیه شد.بررسی اثر ضد باکتریایی عصاره ها به روش انتشار در آگار و به کمک دیسک صورت گرفت .پس ازسه بارتکرار هر آزمون، میانگین قطر هاله عدم رشد اندازه گیري و ثبت شد .سپس با استفاده از روش Broth microdilution حداقل غلظت بازدارندگی از رشد باکتري ها، تعیین شد.از باکتري هاي مورد مطالعه استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس بیش ترین حساسیت را نسبت به عصاره هاي تره کوهی و بومادران داشت. کمترین مقدار MIC هم مربوط به همین باکتري بود که در عصاره الکلی بومادران 6/25 mg/mlگزارش شد.
واژگان کلیدي: اثر آنتی باکتریال، گیاهان دارویی، عفونت مجاري ادراري، ایلام
مقدمه:
عفونت مجاري ادراري از عفونت هاي شایع، به ویژه در زنان، افراد مسن، نوزادان و از مشکلات حاد سازمان هاي متولی بهداشت کشورهاي مختلف محسوب می شوند .از نظر فراوانی رتبه دوم را پس از بیماري هاي تنفسی دارد(.(Nwanzeet al,2007آمار جهانی نشانگر آن است که بیش از 250 میلیون نفر در سال به این بیماري مبتلا می شوند(.(Keahet al,2007از جمله باکتري هاي شایع در این بیماري می توان به اشرشیاکلی، پروتئوس ولگاریس، کلبسیلاپنومونیه، استافیلوکوکوس اپیدرمایدیس، انتروباکتر، سیتروباکتر، پسودوموناس آئروژینوزا اشاره نمود(.(Tanagho et al,2000درمان عفونت هاي ادراريمعمولاً با آنتی بیوتیک صورت می گیرد ولی گزارش مقاومت باکتري هاي پاتوژن نسبت به آنتی بیوتیک ها هر روز درحال افزایش است.براساس تحقیقات انجام گرفته در زمینه شناسایی عوامل بیماريزا و تعیین میزان مقاومت آنتی بیوتیکی آنها مشخص شده است که میزان مقاومت نسبت به آمپی سیلین و آموکسی سیلین در بین باسیلهاي گرم منفی تیره انتروباکتریاسه به ویژه در جنس کلبسیلا با مقاومت 100 درصد چشم گیر است. هم چنین میزان مقاومت در بین سویههاي مختلف استافیلوکوکوس اورئوس بین 70 تا 90 درصد و در مورد سایر استافیلوکوکوسهاي کواگولاز منفی 60 درصد می باشد(.(Oussalah et al,2007
با افزایش تعداد سویههاي باکتریایی مقاوم به آنتی بیوتیکهاي گوناگون، تلاشهاي بسیاري براي استفاده از توان بالقوه خاصیت ضد میکروبی گیاهان انجام پذیرفته است . از طرف دیگر ظهور سویههاي مقاوم در بین باسیلهاي گرم منفی و کوکسیهاي گرم مثبت مانند جنسهاي پسودوموناس، کلبسیلا، انتروباکتر، استافیلوکوکوس و انتروکوکوس مشکلاتی را در درمان عفونتهاي ناشی از این باکتريها بهوجود آورده است( Oussalah .(et al,2007 ترکیبات ضد میکروبی به دست آمده از گیاهان با مکانیسمهاي متفاوت از آنتی بیوتیکها، باکتريها را حذف می کنند که این مسئله در درمان عفونتهاي ناشی از سویههاي مقاوم میکروبی از نظر بالینی حائز اهمیت است.با توجه به رویکرد دوباره ي مصرف داروها وفراوردههاي گیاهی، بررسی خواص دارویی گیاهان اندمیک هر منطقه از اهمیت خاصی برخوردار می باشد.
مواد و روشها:
شناسایی و جمع آوري گیاهان:
این مطالعه تجربی –آزمایشگاهی طی تابستان 1393 در آزمایشگاه میکروبیولوژي دانشگاه ایلام انجام شد.گیاهان دارویی در فصل گل دهی آن از مراتع و مناطق طبیعی اطراف شهر ایلام در اواخر اردیبهشت ماه جمع آوري شد و در درجه حرارت اتاق در سایه خشک سپس با آسیاب پودر شدند و در فریزر نگهداري گردید.
جدول شماره1 -مشخصات گیاهان مورد بررسی علیه سویه هاي مولد عفونت مجاري ادراري
روش عصاره گیري با آب و اتانول:
1000 میلی لیتر آب یا الکل را در بالون ته گرد ریخته، سپس گیاه مورد نظر 300-200) گرم پودر خشک شده گیاه) را در داخل پاکت هایی از جنس کاغذ صافی گذاشته و پاکت ها در درون دستگاه تقطیر قرار داده شد.(مبرد روي دستگاه نصب شد). در دستگاه به مدت 24- 48 ساعت قرار داده شد تا فرایند عصاره گیري توسط دستگاه انجام شود.پس از گذشت این مدت و در اثر بخار آب مقطر یا الکل ،عصاره آبی یا الکلی در مخزن باقی می ماند.سپس عصاره بدست آمده را داخل ظروفی ریخته و در دستگاه فور به مدت 24 ساعت و دماي 50 درجه قرار داده شد.براي تهیه غلظتهاي مختلف از عصاره آبی از آب مقطر وعصاره اتانولی از DMSO استفاده شد.
سویه هاي باکتریایی:
دراین مطالعه 55 سویه باکتري جدا شده از نمونه هاي ادرار بیماران بستري مبتلا به عفونت مجاري ادراري استفاده شدند.این باکتري ها پس ازکشت ادرار بیماران برروي، محیط هاي کشت میکروبی، باکمک رنگ آمیزي گرم و انجام آزمون هاي بیوشیمیایی ازقبیل ، SIM، TSI ، MR،VP، کواگولاز، سیترات و آزمایش تخمیر قندهاي مختلف شناسایی وبه بخش میکروب شناسی جهت بررسی اثر ضد باکتریایی گیاهان دارویی مورد مطالعه، انتقال یافتند.
رقیق سازي عصاره گیاهان وتهیه دیسک هاي حاوي عصاره:
هریک ازعصاره هاي آبی را با آب مقطر و عصارههاي الکلی را با DMSO رقیق کرده وعلاوه برعصاره خالص، غلظت هاي 12/5 mg/ml، 25 ،50،100 ،200، 400 از عصاره تهیه شد، سپس جهت تهیه دیسک هاي حاوي عصاره از دیسک هاي بلانک ساخت پادتن طب استفاده شد. بدین ترتیب که دیسک هاي بلانک را در لوله هاي حاوي رقت هاي تعیین شده عصاره قرار داده و بعدازمدت 3تا5 دقیقه پس از جذب کامل، دیسک ها را در دماي 37 درجه سانتی گراد قرار داده تاکاملا˝خشک شده و جهت دیسک گذاري آماده شدند.
بررسی اثر ضد باکتریایی عصاره ها:
الف -روش انتشار در آگار:
ابتدا ازتمام سویه هاي باکتریایی سوسپانسیون میکروبی معادل 0/5مک فارلند (معادل 1-1/5×108 باکتري درهرمیلی لیتر) تهیه شد و سپس با100 میکرولیتر از سوسپانسیون تهیه شده بر سطح محیط مولرهینتون آگار کشت یکنواخت انجام شد .آن گاه دیسک هاي بلانک استریل، حاوي رقت هاي مختلف عصاره، با فاصله معین از یکدیگر از لبه پلیت بر روي سطح محیط کشت آگار قرار داده شدند .پلیت ها به مدت 24 ساعت در 37 درجه سانتی گراد گرم خانه گذاري گردید و نتایج اثر ضد باکتریایی با اندازه گیري قطر هاله عدم رشد اطراف دیسک ها ثبت شد .براي حصول اطمینان، این آزمایش براي هر سویه باکتري سه بارتکرارشد .میانگین قطر هاله عدم رشد در سه بار تکرار به عنوان قطر نهایی ثبت شد(.(Androw,2001قطر هاله عدم رشد کم تر از8 میلی متر به عنوان مقاوم، 8تا9میلی مترنسبتاً مقاوم، بیش تر از10تا12 میلی مترنسبتاً حساس و بیش تر از12 میلی متر به عنوان حساس درنظر گرفته شد(.(Nostro et al,2001هم چنین از دیسک حاوي پروپیلن گلیکول به عنوان کنترل منفی و از دیسک حاوي آنتی بیوتیک به عنوان کنترل مثبت استفاده شد.
ب-:BrothMicrodillution
در این روش حداقل غلظت بازدارندگی (MIC) مشخص شد.100میکرولیتر از سوسپانسیون باکتري را به چاهکهاي الایزا حاوي 100 میکرولیتر از غلظتهاي مختلف عصاره اضافه شد.تنهاچاهک اول (کنترل مثبت ) حاوي سوسپانسیون میکروبی و محیط مولر هینتون براث و چاهک دوم (کنترل منفی )حاوي سوسپانسیون میکروبی و آنتی بیوتیک جنتامایسین بود .بلافاصله OD را با استفاده از دستگاه الایزا در طول موج 630 نانومتر خوانده و سپس نمونه را در 37 درجه سانتی گراد قرار داده و مجدداًOD دربازه هاي زمانی12و24 ساعت قرائت گردید که در نهایت حداقل غلظتی از عصاره که کاهش OD درآن مشاهده می شد، به عنوان MIC در نظر گرفته شد.تجزیه و تحلیل داده ها و نتایج با استفاده از نرم افزار آماري SPSS
