بخشی از مقاله
چکیده:
ریشههاي مویین گیاه خرفه در ارلنهاي 250 میلی لیتر حاوي محیط مایع 1/2 MS به مدت 4 هفته کشت داده شده و اثر غلظت هاي مختلف دو الیسیتور متیل جازمونات و اسید سالیسلیک بر مقدار دوپامین تجمعی در این ریشهها بررسی گردید. غلظتهاي به کار برده شده براي متیل جازمونات صفر - کنترل - ، 100، 150 و 200 میکرومول و براي اسید سالیسلیک صفر - کنترل - ، 125، 250 و 500 میکرومول بودند. این تیمارها 48 ساعت بعد از پایان دوره 28 روزه، زمانی که فاز نهایی رشد تکمیل گردید، اضافه شدند.
ما متوجه شدیم که غلظتهاي مختلف متیل جازمونات، به ویژه غلظت 100 میکرومول متیل جازمونات فاکتور بسیار قوي در افزایش تولید متابولیت ثانویه دوپامین میباشد. به طوري که این غلظت باعث افزایش 3 برابري غلضت دوپامین نسبت تیمار شاهد گردید. از طرفی هیچ کدام از غلظتهاي به کار برده شده اسید سالیسلیک اثر معنی داري بر تجمع دوپامین نسبت به تیمار شاهد از خود نشان ندادند.
مقدمه:
هزاران سال است که گیاهان از مهمترین منابع درمانی محسوب میشوند.گیاهان همچنین منبع بسیاري از درمانهاي جدید می باشند.تقریبا یک چهارم داروهاي تولید شده حاوي عصارههاي گیاهی یاترکیباتی هستند که از مواد گیاهی به دست آمدهاند یا براساس ترکیبات گیاهی مدل سازي شدهاند - . - 9 با استفاده از پیشرفت هاي بیوتکنولوژي، تولیدات طبیعی گیاهان میتوانند منبع عظیمی از ترکیبات شیمیائی جدید با منشاء گیاهی را براي کاربردهاي گوناگون فراهم کنند.
کشت بافت گیاهان دارویی به عنوان یک راه حل مناسب جهت تولید متابولیت هاي ثانویه با ارزش معرفی شده است . اخیرا کشت ریشه هاي موئین1 به عنوان یک منبع پایدار براي تولید متابولیت ها پیشنهاد شده است. ریشه هاي مویین با استفاده از آگروباکتریوم رایزوژنز2 تولید میشوند. بزرگترین مزیت کشت ریشه هاي مویین این است که اغلب در مقایسه با گیاهان مادري، توان بالایی در تولید متابولیت هاي ثانویه3 دارند - . - 3 خرفه با نام علمی Portulaca oleracea L. گیاهی علفی و گوشتدار است که تقریبا در تمام نقاط ایران پراکندگی دارد و در مناطق جنوبی ایران به عنوان سبزي خوردن کاشته می شود - . - 1
این گیاه به عنوان آنتیسپتیک، ضد اسپاسمودیک، دیورتیک، ضد تب، آنتیاکسیدان، تقویت سیستم ایمنی، تصفیه کننده خون کاربرد درمانی دارد - . - 6 آزمایشهاي فیتوشیمیایی خرفه نشان داد که این گیاه یک منبع غنی از اسیدهاي چرب امگا-3، الفاتوکوفرول، اسید اسکوربیک و اسید الفالینولنیک، نورآدرنالین، دوپامین و غیره میباشد - . - 7 دوپامین یک ترکیب زیستی از خانواده کاتهکولامینهاست که به عنوان ناقل سیستم عصبی در بدن انسان انجام وظیفه میکند. امروزه از این ترکیب در درمان بیماري پارکینسون، نقص تراکمی قلب و در عملکرد غیر عادي دریچه مایوکاردیال مورد استفاده قرار میگیرد - . - 11 در این مقاله ما تاثیر غلظتهاي مختلف دو نوع الیسیتور متیل جازمونات و اسید سالیسلیک را بر تجمع دوپامین در ریشههاي مویین گیاه خرفه را مورد بررسی قرار دادهایم.
مواد و روشها مواد گیاهی
بذور گیاه خرفه از باغ گیاهان دارویی همدان در اسفند 89 جمعآوري گردیدند. بذرها به آزمایشگاه منتقل و بعد از ضد عفونی در پتريهاي استریل حاوي کاغذ صافی مرطوب کشت داده شدند. بعد از گذشت 2 هفته از رشد گیاهچهها، از برگهاي لپهاي به عنوان ریزنمونه استفاده شد.
استرین باکتریایی و القاء ریشههاي مویین
جهت القاء ریشههاي مویین از استرین 15834 اگروباکتریوم رایزوژنز استفاده شد. این استرین از مرکز تحقیقات بیوتکنولوژي کرج تهیه گردید. براي تولید ریشههاي مویین ابتدا ریزنمونههاي برگی 14 روزه از گیاه جدا و در محیط LB مایع حاوي آگروباکتریوم به مدت 10 دقیقه غوطهور شدند. پس از اتمام 10 دقیقه، ریزنمونهها براي خشک شدن به کاغذ صافی مرطوب و سپس به محیط کشت 1/2 MS جهت همکشت با باکتري منتقل گریدند.
بعد از 2 روز همکشتی، ریزنمونهها به محیط 1/2 MS حاوي سفاتوکسیم، جهت حذف آگروباکتریوم انتقال داده شدند. پس از ایجاد ریشه هاي موئین، استخراج DNA از ریشه ها پس از چندین مرحله واکشت نمودن واطمینان ازحذف باکتري به روش کاي و همکاران انجام گرفت - . - 2 براي تایید مولکولی ریشه هاي موئین از روش PCR1 با آغاز گرهاي اختصاصی براي ژن rolB موجود در ناحیه T-DNA وارد شده به ژنوم گیاهی استفاده گردید.
استخراج و جداسازي دوپامین از ریشههاي مویین
جهت استخراج دوپامین از روش چن و همکاران استفاده شد - . - 3 همچنین جهت تعیین مقدار دوپامین از سیستم HPLC کانیور - برلین، آلمان - با ستون - 25 cm × 4.6 mm - C18 و دتکتور UV استفاده گردید. فاز متحرك شامل 0/02 مولار محلول 95 - KH2 PO4 درصد - ، استونیتریل - 5 درصد - ، pH 3.0 و طول موج 280 نانومتر بود.
آماده سازي الیسیتورها2
در این مطالعه از دو الیسیتور متیل جازمونات - با خلوص 95 درصد و خریداري شده از شرکت سیگما - با غلظتهاي صفر - کنترل - ، 100، 150 و 200 میکرومول و همچنین اسید سالیسلیک - خریداري شده از شرکت سیگما - با غلظتهاي مختلف صفر - کنترل - ، 125، 250 و 500 میکرومول استفده گردید. از اتانول 96 درصد و 0/1 NaoH نرمال به ترتیب براي حل کردن متیل جازمونات و اسید سالیسلیک استفاده شد.
آنالیز آماري
الیسیتورها 4 هفته بعد از کشت ریشههاي مویین جهت ارزیابی مقدار دوپامین مورد استفاده قرار گرفتند. ریشههاي تیمار شده با متیل جازمونات و اسید سالیسلیک 48 ساعت بعد از پایان دوره 4 هفته - 28 روز - برداشت گردیدند. ریشههاي تیمار نشده با الیسیتور نیز به عنوان تیمار شاهد مورد استفاده قرار گرفتند. براي رسم نمودار از نرمافزار EXCEL 2007 و جهت انجام آزمون آماري تیمارها از روش تچزیه واریانس SAS 9.1 استفاده شد.
نتایج و بحث
نتایج به دست آمده از القاء ریشههاي مویین، تنوع گستردهاي از رشد ریشهها بعد از همکشتی با آگروباکتریوم رایزوژنز را نشان داد - شکل 1الف و ب - .ریشهها داراي ویژگیهاي همچون رشد سریع، انشعابات جانبی فراوان و رشد در محیط فاقد هورمون بودند. امروزه القاء ریشههاي مویین توسط آگروباکتریوم رایزوژنز جهت تولید متابولیتهاي ثانویه بسیار مورد توجه بیوتکنولوژیستها قرار گرفته است. ریشههاي مویین میتوانند به طور نامحدود بر روي محیط کشت فاقد هورمون رشد کنند. مزیت اصلی استفاده از کشت ریشههاي مویین به دلیل تواناي رشد آنها در محیطهاي پایهاي تعریف شده فاقد هورمون میباشد. این ریشهها به دلیل طبیعت متمایزشان، داراي یک پایداري ژنتیکی بوده و تمایل به تولید سطوح بالایی از متابولیتهاي ثانویه دارند - . - 8 همانطور که در شکل 2 نشان داده شده است، نتایج مربوط به ژل الکتروفورز نشان دهنده حضور ژن rolB در ریشههاي مویین میباشد.
