بخشی از مقاله
چکیده
در این پژوهش به بررسی تاثیر سالسیلیک اسید و متیل جاسمونات بر متابولیت های ثانویه و همچنین اثر آنتی اکسیدانی و ضد رادیکالی گیاه نعنا فلفلی Mentha piperita L پرداخته شد. این گیاه قبل از گلدهی با محرکهای رشد سالسیلیک اسید و متیل جاسمونات با غلظتهای 50و 100 میکرومولار تیمار شدند.ابتدا 3روز با سالسیلیک اسید سپس 3روز با متیل جاسمونات مورد تیمار قرار گرفتند.میزان محتوای فنلی و فلاونوئیدی تام به روش اسپکتروفوتومتری صورت گرفت.فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره گیاه در غلظت های مختلف با استفاده از روش مهار رادیکال آزاد 2و2 دی فنیل-1پیکریل هیدرازیل - - DPPH اندازه گیری شد.تجزیه و تحلیل داده ها با نرم افزار SPSS نسخه 16و روش آزمون آنالیز واریانس انجام شد.
همچنین میزان ترکیبات فنلی حاصل از عصاره متانولی بر حسب میلی گرم های گالیک اسید بر گرم نمونه به ترتیب در شاهد باآب،شاهد با الکل،تیمار 50 میکرومولار و تیمار 100 میکرومولار 200، 300، 305 و 265 بوده و میزان ترکیبات فلاونوئید تام عصاره متانولی بر حسب میلی گرمهای کوئرستین به ترتیب 11.6، 7.9 ، 18 و 24 و غلظت مهار 50 درصد - IC50 - این عصاره ها به ترتیب 138.22 ، 105.72، 144.97 و 125.93 بودند.میزان اسانس نیز بویژه در غلظت 100 میکرومولار افزایش یافت. با کمک این دو السیتور می توان با ایجاداثرات تحریکی ،میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی و همچنین فعالیت آنتی اکسیدانی را افزایش داد.بنابراین می توان از این روش برای بهینه سازی و تولید بیشتر ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی و و افزایش اثر آنتی اکسیدانی گیاه نعنا فلفلی استفاده نمود.
کلید واژها :نعنا فلفلی،متیل جاسمونات،سالسیلیک اسید،اثر آنتی اکسیدانی، ترکیبات فنلی، ترکیبات فلاونوئید
.1مقدمه
جاسمونات ها و استر متیل آنها - متیل جاسمونات - گروه جدیدی از تنظیم کنندگان رشد گیاهان واز مشتقات لینولنیک اسید محسوب می شوند،که از طریق مسیر سنتزی اکادکانوئید ساخته می شودو مشابه سایر هورمونهای گیاهی،اثرات بیولوژیکی متنوعی نظیر تسریع پیری و ریزش برگ،پیچش،بسته شدن روزنه، ممانعت رشد ریشه و جوانه زنی بذرهای خفته رااعمال می کنند - R.A Creelman et - al.,1997,F.Schaller .جاسمونات ها به عنوان ترکیبات پیام رسان کلیدی در فرآیند القا منجر به تجمع متابولیت های ثانویه می شود - H D. Dong et al., 2001, J.Ebel et . - al.,1998 ,E .Szabo et al., 1999, K W. yu et al.,2002 - سالسیلیک اسید نیز یکی دیگر از ملکولهای پیام رسان در تنشهای سلولی محسوب می شود که در خصوص نقش آن در تاثیر بر مقاومت گیاه در برابر پاتوژنها و سایر تنشهای زیستی مطالعات زیادی صورت گرفته است - - LJ. Yu et al.,2001در واقع سالسیلیک اسید به عنوان یک جز پیام رسان کلیدی در فعال سازی پاسخ های اختصاصی دفاعی گیاه شناخته می شود.پاسخ های دفاعی گیاه منجر به بیوسنتز و تجمع انواع ترکیبات ثانویه گیاهی می گردد،لذا القا به عنوان راهکاری موثر برای افزایش متابولیت های ثانویه مانندالکالوئیدها، ترپنوئیدها،فلاونوئیدها،ترکیبات فنولیک و فیتوالکسین ها شناخته شده است.. - - M J.Mueller et al.,1993
نعنا فلفلی با نام علمی piperita L Mentha که دررده بندی گیاهی از تیره lamiaceae است.در حال حاضر در ایران ازاسانس نعناع فلفلی همراه دیگر گونه های گیاهی در ساخت داروهای گیاهی به صورت قرص جویدنی-مکیدنی شربت و قطره و همچنین در صنایع غذایی- بهداشتی و آرایشی-شیرینی پزی-نوشابه سازی و تولید ادویه مورد استفاده قرار می گیرد. نعناع فلفلی به دلیل خواص چاشنی و بادشکنی با دیگر گیاهانی که برای تولید چای استفاده می شوند در ارتباط است.و به دلیل داشتن منتول خاصیت ضد نفخ و ضد میکروبی قوی و ضد اسپاسم، دارد. - حیدری.ف و همکاران،. - 1387 رادیکال های آزاد علاوه بر اثرات نامطلوب روی مواد غذایی سبب تغییر ترکیبات شیمیایی آن می شوند وباعث ایجاد ترکیبات سمی در انهاشده که منجر به عوارضی ازجمله بیماریهای التهابی ،دیابت ،سرطان و نقض در سیستم ایمنی بدن می شود. - K.Robards et al.,1988,C.Henry et al.,2002.
به همین دلیل استفاده از آنتی اکسیدان ها به منظور کاهش سرعت اکسیداسیون در مواد غذایی ضروری است - - al.,1983 al.,2002 M.Antolovich etگیاهان با دارابودن ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی دارای پتانسیل آنتی اکسیدانی هستند. . - B M.Ames et al,1983 - به همین دلیل استفاده از گیاهان در صنایع غذایی و دارویی وبهداشتی که به عنوان منبع سهل الوصول صورت می گیرد. هدف این پژوهش این است که با استفاده از سالسیلیک اسید و متیل جاسمونات به عنوان السیتورهای شیمیایی میزان متابولیت های ثانویه و فعالیت آنتی اکسیدانی گیاه نعنا فلفلی راافزایش دهیم.
.2 روش تحقیق
گیاه نعنا فلفلی Mentha piperita Lرا همسن و همسال از دانشکده داروسازی دانشگاه تهران تهیه و ریزوم های تازه در گلدان هایی به قطر12cm با خاک برگ فسفاته و بخار داده شده - جهت جلوگیری از رشد قارچ و علف های هرز - کاشته شدند.نمونه های مورد مطالعه به مدت 7 هفته ،در دمای محیطی 24Fو طول روشنایی 16 ساعت نگهداری شده اند.سپس اضافه نمودن - اسپری کردن به اندام های هوایی و سطح خاک - ابندا سالسیلیک اسید به مدت 3 روز و سپس متیل جاسمونات به مدت 3 روز بعد از آن با غلظتهای 50و100 میکرومولار در 2 گروه تیمار صورت گرفت.بنابراین در 1 گروه غلظت 50 میکرومول هر دو الیسیتور و گروه دوم غلظت 100 میکرومول دو الیسیتور سالیسیلیک اسید و متیل جاسمونات انجام شد.گروهای مشابه با این گیاهان به لحاظ تعداد و شرایط یکنواخت به عنوان گروهای شاهد با آب و شاهد با الکل در نظر گرفته شدند.در نهایت صبح روز 7 اندام های هوایی گیاهان - ساقه و برگ - در هر چهار گروه - و هر گروه در سه تکرار - جمع آوری و به مدت 5 روز در سایه خشک گردیدند.سپس نمونه های 4 گروه تیمارها و شاهدهاپودر شده و برای عصاره گیری و اسانس گیری آماده شدند.
.1-2 استخراج اسانس
ابتدا 7 گرم از پودر حاصل از نمونه های شاهد و تیمار را در داخل بالن حاوی آب مقطر قرار داده و به روش تقطیر با آب به کمک دستگاه کلونجر اسانس گیری صورت گرفت.اسانس حاصل روی سطح آب داخل مبرد جمع آوری شد .بوی نافذ و رنگ زرد کم رنگ از مشخصات فیزیکی اسانس مربوطه است.
.2-2تهیه عصاره ها
از مابقی پودرهای حاصل از نمونه ها با اضافه نمودن متانول توسط روش پرکولاسیون عصاره تهیه می کنیم. با توجه با اینکه در مقدار نمونه ها با محدودیت مواجه بوده ایم لذا از قیف دکانتور استفاده شده و نمونه های عصاره متانولی آماده شده در ظروف پلاستیکی درب بسته در یخچال در دمای +4& قرار داده شده اند.
.3-2مواد شیمیایی
کلیه مواد شیمیایی و حلال هی مورد استفاده در این تحقیقات از شرکت Merk آلمان و رادیکال آزاد DPPH در شرکت سیگما آمریکا خریداری شد و دارای بالاترین درصد خلوص بوده اند.
.4-2اندازه گیری محتوای تام فنلی
محتوای تام فنولیک با استفاده از معرف فولین- سیوکالتیو اندازه گیری شده است.به این منظور به .5میلی لیتر از هر عصاره 2.5 ml, 10 mg/mlواکنشگر فولین سیوکالتیو .2 بررسی خاصیت آنتی اکسیدانی به روش مهار رادیکالی آزاد 2 و2 دی فنیل -1 پیکریل هیدرازین - DPPH - توانایی دادن اتم هیدروژن یا الکترون در ترکیبات و عصاره های مختلف در این است با میزان بی رنگ کردن، محلول بنفش 2و -2دی فنیل - -1 پیکریل هیدرازیل یا DPPHدر متانول مورد سنجش قرار می گیرد.در این روش - - Bucar ,2000Burits& ترکیب رادیکالی پایدار از ماده DPPHسیگما الدریچ به عنوان ماده اصلی برای تعیین اثر آنتی اکسیدانی استفاده شده است.
بدین ترتیب که 1mlاز غلظتهای مختلف عصاره های متانولی و3ml محلول 0.004 درصد DPPHدر متانول اضافه گردید و بعد از نیم ساعت در تاریکی در دمای اتاق جذب نوری نمونه ها در طول موج 517 nm در مقابل بلانک قرائت شدو درصد مهاررادیکالی آزاد DPPH با استفاده از فرمول زیر محاسبه می گردد. در این فرمول A blank میزان جذب نوری کنترل منفی که تمامی مواد به استثنای عصاره ها را دارد نشان می دهد. و A نرمال اضافه شده و پس از 5 دقیقه 2 ml از محلول کربنات سدیم به آن اضافه گردید.مقدار جذب مخلوط بعد از 1 ساعت نگهداری در تاریکی در طول موج 765 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفوتومتر در مقابل بلانک قرائت شده از گالیک اسید به عنوان استاندارد برای رسم منحنی کالیبراسیون بکار گرفته شد و در نهایت میزان محتوای تام فنولیک بر اساس معادل میلی گرم اسید گالیک در گرم عصاره گزارش گردید - . - O.Lorenzo.,2003
.5-2 اندازه گیری محتوای تام فلاونوئید
اندازه گیری محتوای تام فلاونوئیدی با اضافه نمودن کلرید آلومینیوم صورت گرفت.لذا 0.5 ملی لیتر از هر عصاره ، - 10 1.5ml - mg/ml - متانول 0.1از محلول آلومینیوم کلراید %10 در اتانول 0.1ml از استات پتاسیم 1 مولار و 2.8 ml آب مقطر اضافه گردید.جذب مخلوط نیم ساعت بعد از نگهداری در دمای اتاق در تاریکی و طول موج 415 نانومتر در مقابل بلانک قرائت شد.از کوئرستین به عنوان استاندارد برای رسم منحنی کالیبراسیون بهره برده شده است.میزان فلاونوئید بر اساس براساس معادل میلی گرم اسید گا لیک در گرم عصاره گزارش گردید .آزمایشات 3 بار تکرار و میانگین آنها گزارش شد - . - C C.Chang et al2002
.6-2 ارزیابی فعالیت آنتی اکسیدانی
sampleبیانگر جذب نوری غلظت های مختلف عصاره های گیاه می باشد.پس از آن غلظتی از عصاره های گیاه که دارای درصد مهار رادیکالهای آزاد ،بیشتر می باشد در این تست به عنوان کنترل مثبت از آنتی اکسیدان سنتزی BHT استفاده گردید و کلیه ی آزمایشات سه بار تکرار گردید.
.7-2آنالیز آماری
در تحلیل تجزیه اطلاعات بدست آمده برای تعیین میانگین انحراف معیار و رسم نمودارها از بسته نرم افزار Excelاستفاده شده است.همچنین برای تعیین معنی دار بودن تفاوت ها در سطح p 0.01از تجزیه واریانس یک طرفه - - ANOVA در بسته نرم افزاری SPSSاستفاده شد.
.3نتایج
1-3فعالیت آنتی اکسیدانی ومیزان اسانس
