بخشی از مقاله
چکیده
پوسیدگی فوزاریوم خوشه که توسط قارچ F.graminaerum ایجاد میشود، یکی از بیماريهاي مهم گندم - - Triticum aestivum L. و سایر غلات دانه ریز میباشد. هدف از این بررسی مطالعه الگوي بیان ژن کالکون سینتاز جهت روشن ساختن دخیل بودن این ژن در فرآیند دفاعی گیاه نسبت به قارچ فوزاریوم میباشد. براي این منظور از دو رقم فلات و سومايتري به ترتیب به عنوان ارقام حساس و مقاوم استفاده گردید. نمونهبرداري از سنبلههاي آلوده در زمانهاي مختلف صورت گرفت و با استفاده از روش کمی - QRT-PCR - Real-Time PCR بیان ژن کالکون سینتاز بررسی شد. نتایج نشان داد که تجمع رونوشتهاي ژن کالکون سینتاز در رقم حساس فلات در 7 روز پس از آلودگی به طور معنی داري کاهش یافت، در حالیکه بیان این ژن در رقم مقاوم سومايتري تغییر قابل ملاحظهاي نشان نداد.
مقدمه
بلایت فوزاریومی سنبله گندم1 که توسط گونههاي مختلف قارچ فوزاریوم2 ایجاد میشود، یکی از بیماريهاي مهم گندم در مناطق گرم و مرطوب جهان به شمار میآید. این بیماري باعث کاهش شدید عملکرد و افت کیفیت دانه میشود - . - 4 مایکوتوکسینهاي تولید شده توسط عامل بیماري مانند دي اکسی نیوالنول3 باعث ایجاد مسمومیتهاي شدید در انسان و دام میشود. از آنجایی که مبارزه شیمیایی در ارتباط با بیماري مناسب نمیباشد، انتخاب و استفاده از ارقام مقاوم با صفات زراعی برتر، بهترین راه مبارزه و کنترل بیماري محسوب میشود. اخیراً مطالعات چندي نشان داده است که آلودگی گندم به F.graminearum سبب القاء تجمع رونوشتهاي چندین کلاس از ژن هاي مرتبط با استرسهاي زنده و غیر زنده در کولتیوارهاي مقاوم و حساس به فوزاریوم سنبله گندم میگردد - . - 3 تولید ترکیبات فیتوآلکسین ضد قارچی بستگی به فعالیت یک سري از آنزیمهاي ثانویه مانند کالکون سینتاز دارد. امکان کنترل اسکب گندم از طریق مهندسی ژنتیک گیاهان براي بیان ژنهاي رمز کننده پروتئینهاي مرتبط با بیماریزایی در سالهاي اخیر کشف شده است. هدف از این بررسی مطالعه بیان ژن کالکون سینتاز در دو رقم سومايتري - مقاوم - و فلات - حساس - به منظور مشخص نمودن دخیل بودن این ژن در فرآیند دفاعی گیاه نسبت به قارچ فوزاریوم میباشد.
مواد و روشها
در این مطالعه از دو واریته سومايتري واریته چینی مقاوم به فوزاریوم سنبله گندم و واریته فلات، واریته ایرانی حساس به فوزاریوم سنبله گندم استفاده شد. این دو رقم در ایستگاه تحقیقات گرگان کشت شدند. سپس در زمان گلدهی، 10 میکرولیتر از اسپورهاي قارچ با غلظت 105 اسپور در هر میلیلیتر، به وسیله میکروپیپت به داخل گلچه میانی تزریق گردید. سنبلههاي مایه زنی شده با کیسههاي پلاستیکی پوشانده شد. نمونه برداري از سنبلههاي آلوده در 1،3 و 7 روز پس از آلودگی انجام گرفت. استخراج RNA کل با استفاده از کیت RNX-PLUS انجام شد. سپس با استفاده از DNaseI، DNA ژنومی حذف شد و از روي RNA کل، cDNA تک رشتهاي با استفاده از کیت شرکت فرمنتاز ساخته شد و از این cDNA در روش Real-Time PCR کمی با استفاده از کیت سایبرگرین استفاده گردید. جهت شناسایی ژن کالکون سینتاز از یک جفت آغازگر اختصاصی طراحی شده از ژنوم گندم استفاده شد. از ژن کنترل خانهدار GAPDH به عنوان ژن کنترل مرجع استفاده گردید. پس از انجام Real-Time PCR از نرم افزار REST به منظور بررسی الگوي تظاهر ژن استفاده شد.
نتایج و بحث
نتایج این بررسی نشان داد که ژن کالکون سینتاز در هر دو رقم فلات - حساس به قارچ فوزاریوم - و سومايتري - مقاوم به قارچ فوزاریوم - در زمانهاي مختلف بیان افتراقی داشت. به طور کلی در رقم حساس فلات بیان ژن کالکون سینتاز پس از تلقیح قارچ کاهش یافت. به طوریکه در 24 ساعت اولیه پس از آلودگی کاهش در بیان ژن مشاهده شد. بیشترین میزان کاهش در بیان این ژن مربوط به 7 روز پس از آلودگی بود. در رقم مقاوم سومايتري پس از تلقیح قارچ عامل بیماري افزایش در بیان ژن مشاهده گردید، هر چند این افزایش در بیان ژن نسبت به زمانهاي قبل از آلودگی معنی دار نبود - جدول . - 1 در آزمایشهاي مختلف دیگر نیز مشخص شده است بیان ژن کالکون سینتاز در واکنش به قارچها فعال شده است. آرفوي و همکاران - - 1 پس از تیمار گیاه نخود توسط قارچ فوزاریوم بیان داشتند تجمع رونوشتهاي ژن کالکون سینتاز در واریته مقاوم نسبت به واریته حساس میزان بیشتري داشته است.
جدول -1 الگوي بیان ژن کالکون سینتاز در دو رقم مقاوم - سومايتري - و حساس - فلات - نسبت به قارچ فوزاریوم کالکون سینتاز آنزیم کلیدي بیوسنتز فلاونوئیدها میباشد. فلاونوئیدها نقش مهمی در حفاظت گیاه بر علیه نور UV، دفاع در مقابل پاتوژن ها، القاء تشکیل گرهها، انتقال هورمون اکسین و مقاومت در مقابل حشرات و ایجاد فیتوآلکسینها ایفا میکنند - . - 2 کاهش شدید بیان این ژن در رقم حساس فلات پس از ایجاد آلودگی سبب اختلال در فعالیت این آنزیم و در نتیجه تولید ترکیبات مسیر بیوسنتز فلاونوئیدها و ترکیبات ضد قارچی دیگر میشود و بنابراین سبب کاهش مقاومت به قارچ فوزاریوم میگردد. با تحریک بیان این ژن توسط تیمارهاي مختلف مانند سالسیلیک اسید، میتوان سبب افزایش در بیان این ژن و در نتیجه افزایش مقاومت گردید.
