بخشی از مقاله
چکیده
استفاده از فاکتور رشد اپیدرم - EGF - باعث افزایش نرخ بلاستوسیت در کشت آزمایشگاهی رویان گاو میشود. نیازهای تغذیهای رویان پستانداران طی نمو در مرحلهی پیش از لانهگزینی تغییر میکند که با تغییرات در ترشحات دستگاه تولید مثلی ماده همزمان است. بنابراین برای نمو بهینهی رویانهای پستانداران استفاده از محیطهای دومرحلهای که با تغییر نیازهای تغذیهای رویانها در پیش از لانه گزینی متناسب باشد، پیشنهاد میشود. موضوع این تحقیق بررسی اثر EGF در محیط دو مرحلهای بر نرخ کلیواژ و نرخ تولید بلاستوسیست می باشد. تخمکها از فولیکولهایی با قطر 2-6 میلیمتر آسپیره شدند و وارد محیط بلوغ شدند و پس از 24 ساعت، تخمکهای بالغ وارد محیط لقاح شدند. تخمکهای بارور شدهی احتمالی در دو گروه تیماری از محیطهای کشت دومرحلهای جنین انسانی G1 و G2 یکی بدون EGF و دیگری دارای 10 نانوگرم در میلیلیتر EGF در هر دو مرحله به مدت 9 روز برای بهدست آمدن بلاستوسیتها کشت داده شدند. آزمایش در سه تکرار صورت گرفت و نتایج به صورت درصد کلیواژ و نرخ تولید بلاستوسیست به ازای هر کلیواژ ثبت شدبررسی. آماری در قالب طرح کاملاً تصادفی با دو تیمار و بهکمک نرمافزار SAS و با رویهی GLM انجام شد و مقایسات بر اساس LSMEANS و آزمون توکی در سطح معنیداری 0/05 صورت گرفت. EGF در محیط کشت دومرحلهای بر نرخ کلیواژ مؤثر نبود - p>0/1 - ولی بر نرخ تولید بلاستوسیست اثر معنیدار داشت . - p<0/05 - این اثر میتواند به دلیل اهمیت تغذیهای آن در سنتز پروتئین و یا تحریک تقسیمات میتوزی رویان باشد.
واژههای کلیدی: EGF، کلیواژ، بلاستوسیست، محیط کشت دومرحلهای مقدمه
استفاده از EGF باعث افزایش نرخ بلاستوسیت در کشت آزمایشگاهی رویانهای گاوی میشود . - 9 - با توجه به اینکه بیان ژن PDGF-b در اویداکت گاو به اثبات رسیده، به احتمال بسیار زیاد این فاکتورهای رشد، در رشد طبیعی رویان نقش دارند . - 10 - احتمالا بین FGF و EGF در صورت افزوده شدن به محیط کشت رویان، یک اثر تعاونی مثبت برای رشد رویان وجود دارد . - 7 - در یک آزمایش که اثر چندین فاکتور رشد مورد بررسی قرار گرفت مشخص شد که این فاکتورها اثر معنیداری بر رشد رویانها در مراحل ابتدایی جنینی در محیط فاقد سرم دارند . - 9 - وجود mRNAی گیرندههای EGF از مرحلهی دو سلولی تا بلاستوسیست در رویان گاو اثبات شده است، و نشان دهندهی اثر مثبت در مراحل ابتدایی نمو رویان است. نیازهای تغذیهای رویان پستانداران در طی نمو در مرحلهی پیش از لانهگزینی تغییر میکنند که با تغییرات در ترشحات دستگاه تولید مثلی جنس ماده از اویداکت به رحم همزمان است. بنابراین برای نمو بهینهی رویانهای پستانداران استفاده از محیطهای دو یا چند مرحلهای که با تغییر نیازهای تغذیهای رویانها در پیش از لانه گزینی متناسب باشد، پیشنهاد میشود . - 3 - با توجه به این یافتهها یک محیط کشت دو مرحلهای توسط گاردنر و لان برای رویانهای انسان تهیه شد . - 5 - بلاستوسیستهای حاصل با استفاده از این محیطها دارای کیفیت بهتری نسبت به روش همکشتی با سلولهای سوماتیک بودند . - 6 - این محیط دو مرحلهای بر اساس تغییرات نیازهای کربوهیدراتی و آمینواسیدی رویانها است، و در نتیجه نرخ بالای بلاستوسیت را باعث میشود . - 2 - موضوع این تحقیق بررسی اثر EGF در این محیط دو مرحلهای بر نرخ کلیواژ و نرخ تولید بلاستوسیست می باشد.
مواد و روشها جمعآوری و بلوغ آزمایشگاهی تخمک- تخمدانها از کشتارگاه جمعآوری شده و در نرمال سالین با دمای 30-35 درجه سانتیگراد به آزمایشگاه منتقل شدند. تخمکها با روش آسپیره از فولیکولهایی با قطر 2-6 میلیمتر جدا شدند. سپس تخمکهای دارای سیتوپلاسم یکپارچه و حداقل سه لایه کومولوس در زیر میکروسکوپ جدا شده و سه مرتبه در قطرههای 250 میکرولیتری از محیط 3 + TCM199 میلیگرم در میلیلیتر BSA شستشو داده شدند. سپس تخمکهای دارای کمپلکسهای کومولوس به-صورت دستههای 10-15 تایی در قطرات 50 میکرولیتری از محیط بلوغ TCM199 - ، FBS %10 و 100 نانوگرم در میلی-لیتر - EGF، به مدت 24 ساعت در انکوباتور تحت شرایط دمای 38/5 C ، CO2 %5 و رطوبت حداکثر کشت داده شدند.
لقاح آزمایشگاهی- برای تهیهی اسپرم از اپیدیدیمیس تازه استفاده شد. اسپرمهای متحرک پس از شستشو در محیط HEPES TALP با روش Swim up جدا سازی شدند. تخمکهای بالغ که کومولوسهای کاملاً گسترشیافته داشتند، پس از شستشو در قطرات 50 میکرولیتری محیط لقاح - TALP-IVF بههمراه 10 میلیگرم در میلیلیتر هپارین - ، درگروههای 10-15 تایی قرار داده شدند و با 5 میکرولیتر اسپرم با غلظت 10×106 در میلیلیتر ، برای ایجاد غلظت نهایی 1×106 در میلیلیتر اسپرم، تلقیح شده و در درون انکوباتور به مدت 22 ساعت وشرایط دمای 38/5 C ، CO2 %5 و رطوبت حداکثر قرار داده شدند.
کشت آزمایشگاهی رویان- ابتدا تخمکهای بارور شدهی احتمالی از سلولهای کومولوس جدا شده و پس از شستشو بهصورت تصادفی در داخل دو گروه تیماری از محیطهای کشت دومرحلهای جنین انسانی G1 و G2 معرفیشده توسط گاردنر و لین - 4 - ، یکی بدون EGF و دیگری دارای 10 نانوگرم در میلیلیتر EGF در هر دو مرحله به مدت 9 روز برای بدست آمدن بلاستوسیت-ها کشت داده شدند. این آزمایش در سه تکرار با شرایط مشابه صورت گرفت و نتایج به صورت نرخ تولید بلاستوسیست به ازای هر کلیواژ ثبت شد.
بررسی آماری دادهها- آنالیز در قالب طرحکاملاً تصادفی با دو تیمار و بهکمک نرمافزار SAS و با رویهی GLM انجام شد و مقایسات بر اساس LSMEANS و آزمون توکی در سطح معنیداری 0/05 صورت گرفت.
نتایج و بحث
در این آزمایش بهدلیل اهمیت تغییر شرایط رویان در اویداکت و رحم، از محیط کشت دو مرحلهای برای رشد رویان گاو استفاده شد. تخمکهای بارورشده پس از 24 ساعت وارد محیط G1 شدند، و پس از گذشت 35 ساعت از لقاح، سلولهای تقسیمنشده جدا شدند و درصد کلیواژ ثبت شد. رویانها پس از 72 ساعت به محیط G2 منتقل شدند. هر دوی محیطها بهصورت دو گروه تیماری دارای EGF و بدون EGF در سهتکرار در نظر گرفته شدند. رویانها در روز نهم در زیر میکروسکوپ مورد بررسی قرار گرفتند و تعداد بلاستوسیستها ثبت شد - شکل . - 1 نتایج درصد کلیواژ و نرخ بلاستوسیست بهازای هر کلیواژ در جدول 1 آمده است.
شکل:A -1 رویانها در مرحلهی 8-16 سلولی، :B رویانها در مرحلهی بلاستوسیت. سه بلاستوسیست شکوفاشده درشکل مشاهده میشود.
باستان و همکاران اثر دوزهای مختلف EGF را در محیط بلوغ، بر بلوغ تخمک گاو و باروری و تکامل رویان در دو محیط یک-مرحلهای و دو مرحلهای مقایسه کردند و اختلاف معنیداری در تولید بلاستوسیست در دو محیط مشاهده نکردند، اگرچه در هر دو محیط بر تکامل بلاستوسیست مؤثر بود . - 1 - در این آزمابش از 100 - EGF نانوگرم در میلیلیتر - بهدلیل اثرات مثبت بر بلوغ میوزی تخمک و گسترش سلولهای کومولوس و افزایش نرخ کلیواژ - 8 - در محیط بلوغ استفاده شد و اثر آن با دوز10 نانوگرم در میلیلیتر بر افزایش نرخ کلیواژ در محیط کشت دومرحلهای G1/G2 مورد بررسی قرار گرفت. بررسی آماری نشان داد که تیمار EGF با تیمار کنترل - بدون - EGF از نظر درصد کلیواژ تفاوت معنیداری نداشت و EGF در محیط کشت دومرحلهای بر نرخ کلیواژ مؤثر نبود - p>0/1 - که این نتیجه با مطالعهی لونرگان و همکاران مطابقت دارد. آنها اعلام کردند که EGF در محیط SOF - مایع سنتزی اویداکت - بر نرخ کلیواژ رویان گاو اثر معنیداری نداشت . - 8 -
جدول -1 اثر 10 نانوگرم در میلیلیتر EGF در محیط کشت دومرحلهای G1/G2 بر نرخ کلیواژ و بلاستوسیست
