بخشی از مقاله
چکیده
پنبه از محصولات مهم و با ارزش کشاورزي محسوب می شود که اعمال روش هاي مدرن اصلاح نباتات - بیوتکنولوژي - در کنار روش هاي سنتی در مورد آن بسیار مهم است. در این بررسی ریزنمونه هاي پنبه با هدف ارائه محیط هاي کشت مناسب براي رویان زایی بدنی این گیاه در محیط کشت پایه MSB به همراه مواد تنظیم کننده رشد گیاهی کشت شدند. از میان ریزنمونه ها محور هاي زیر لپه اي و از میان محیط ها محیط هاي کشت داراي مخلوطی از هورمون هاي کینتین و 2،-4 دي کلروفنوکسی استیک اسید 0/1 - میلی گرم در لیتر از هر یک از این هورمون ها - به همراه سایر مواد تنظیم کننده رشد گیاهی نظیر ویتامین هاي محیط کشت پایه B5 و نیز گلوتامین و آسپاراژین مناسبترین براي رویان زایی بدنی در پنبه بودند.
مقدمه
گیاه پنبه1 به دلیل کاربرد فراوان در صنایع نساجی یکی از محصولات کشاورزي مهم در سراسر جهان است که اعمال برنامه هاي اصلاحی در مورد آن با روش هاي سنتی بسیار مورد توجه است. با این حال این روش ها به دلایل متعددي از قبیل عدم تنوعات ژنتیکی لازم به ویژه براي مقاومت در برابر آفات و بیماري هاي گیاهی محدود هستند. استفاده از روش هاي بیوتکنولوژیکی در کنار روش هاي سنتی براي غلبه بر این محدودیت ها استفاده می شود.
براي استفاده از مزایاي این روش در مرحله نخست استقرار یک سیستم مناسب براي تکثیر این گیاه با استفاده از اندام زایی و رویان زایی بدنی ضروري می باشد که از حدود 20 سال اخیر بررسی هاي زیادي در باره آن انجام شده است: - 5 - ، 10 - و - 11، - 18 - و . - 20 - با این حال اندام زایی و رویان زایی بدنی در پنبه محدود به ارقام خاصی از آن است که به انجام بررسی هاي بیشتر در این زمینه نیاز دارد.
مواد و روش ها
دانه هاي کرك زدایی شده گیاه پنبه - رقم ورامین - پس از تهیه از مرکز تحقیقات پنبه استان گلستان و انتقال به آزمایشگاه با استفاده از هیپوکلریت سدیم تجاري خالص به مدت 30 دقیقه سترون شدند. دانه هاي سترون شده در محیط کشت پایه - 13 - 0.5MS کشت شده و در شرایط تاریکی نگهداري شدند. 5 الی 7 روز پس از کشت دانه ها از محورهاي زیر لپه اي به طول 5 میلی متر و رئوس رویشی 4 - الی 5 میلی متر - دانه رست ها به عنوان ریزنمونه استفاده شد.
ریزنمونه ها در محیط هاي کشت پایه MS و ویتامین هاي محیط کشت پایه - 7 - B5 همراه با غلظت ها و ترکیبات مناسبی از هورمون هاي ایندول بوتیریک اسید2، کینتین 3، 2،4 دي کلروفنوکسی استیک اسید4 و نفتالن استیک اسید5 کشت شدند. کالوس هاي رویان زاي روي ریزنمونه ها به ارلن مایرهاي 250 میلی لیتري داراي 50 میلی لیتر محیط کشت پایه MSB همراه با 1 میلی گرم در لیتر گلوتامین و 0/5 میلی گرم در لیتر آسپاراژین منتقل شدند. سپس رویان هاي بدنی در مرحله لپه اي به محیط کشت پایه 0.5 MS براي جوانه زنی منتقل شدند. به تمام محیط هاي کشت 30 گرم در لیتر گلوکز و 2/5 گرم در لیتر فیتاژل افزوده شد و pH تمام محیط هاي کشت قبل از اتوکلاو روي 5/8 تنظیم می شد.
نتایج و بحث
هدف از این بررسی ارائه روشی مناسب براي رویان زایی بدنی در گیاه پنبه با تاکید بر انتخاب بهترین محیط کشت می باشد. ریزنمونه هاي پنبه حدود یک ماه پس از استقرار در محیط کشت شروع به واکنش می کردند. تاثیر ترکیبات محیط هاي کشت روي اندام زایی و کالوس زایی از ریزنمونه ها بسیار آشکار بود. ترکیبی از هورمون هاي ایندول بوتیریک اسید و کینتین و ایندول بوتیریک اسید و2،- 4 دي کلروفنوکسی استیک اسید و نیز کینتین به تنهایی براي کالوس زایی روي ریزنمونه ها - محورهاي زیر لپه اي - مناسب بودند. کالوس هاي روي ریزنمونه ها از لحاظ ظاهري و نیز توان اندام زایی و رویان زایی تفاوت بسیار زیادي با هم داشتند.
در ترکیبی از 1 میلی گرم در لیتر ایندول بوتیریک اسید و 0/5 میلی گرم در لیتر کینتین کالوس ها ابتدا رنگ زرد بسیار روش داشته سپس به رنگ سبز متمایل شده و توان اندام زایی - ریشه زایی - بالایی داشتند - شکل . - 1 که بررسی هاي ما در این زمینه با تحقیق انجام شده توسط - 17 - و همکاران در 2008 همسو می باشد. همچنین مقالات بسیار متعددي در باره نقش مثبت ایندول بوتیریک اسید روي ریشه زایی وجود دارد - 4 - ، - 8 - ، - 14 - و . - 15 - ریزنمونه هاي پنبه در محیط هاي داراي هورمون کینتین به تنهایی واکنش هاي متفاوت داشتند.
محورهاي زیر لپه اي در این محیط ها کالوس هاي با رنگ سفید مایل به سبز روشن ایجاد کردند. این کالوس ها در محیط رشد سریع داشته ولی در اندام زایی یا رویان زایی بدنی موفقیت چندانی نداشتند - شکل . - 2 در حالیکه رئوس رویشی در دو حالت بدون لپه و یا با لپه هاي اولیه ساقه هاي نوپدید فراوان روي هر ریزنمونه ایجاد می کردند. ساقه هاي نوپدید مربوط به ریزنمونه هاي داراي لپه هاي اولیه در همان محیط کشت ریشه دار نیز می شدند. در حالیکه براي ریشه دار شدن ساقه هاي نوپدید حاصل از کشت رئوس رویشی به تنهایی انتقال آنها به محیط هاي داراي 0/5 میلی گرم در لیتر نفتالن استیک اسید و 0/1 میلی گرم در لیتر کینتین لازم بود - اشکال 3 و - 2 - . - 4 در 1994، - 9 - در 1997 و - 16 - در 2004 نیز تجربیات مشابهی با تجربه فوق داشته اند.
بر اساس نتایج این بررسی بهترین محیط هاي کشت براي رویان زایی بدنی در گیاه پنبه محیط هاي کشت MSB شامل هورمون هاي کینتین و 2،– 4 دي کلروفنوکسی استیک اسید می باشد. نسبت هاي یکسانی از این دو هورمون 0/1 - میلی گرم در لیتر - ابتدا منجر به ایجاد کالوس هاي رویان زا روي ریزنمونه هاي محورهاي زیرلپه اي می شد. این کالوس ها که رنگ زرد روشن و رشدي سریع در محیط کشت داشتند از توان رویان زایی خوبی نیز برخودار بودند.
به طوریکه وقتی قطر آنها به 7 الی 9 میلی متر می رسید رویان هاي بدنی در مراحل مختلف رشدي روي آنها ظاهر می شدند. این رویان هاي بدنی مراحل رشد بیشتر و همچنین جوانه زنی را در محیط هاي کشت به ترتیب MSB همراه با 1 میلی گرم در لیتر گلوتامین6 و 0/5 میلی گرم در لیتر آسپاراژین7 و محیط کشت پایه بدون مواد تنظیم کننده رشد گیاهی 0.5MS طی کردند - اشکال 5 تا . - 6 همانطور که نتایج حاصل از این بررسی نیز نشان می دهد هورمون 2,4-D یکی از موثرترین و بهترین هورمون ها براي رویانی زاي بدنی می باشد.
