بخشی از مقاله
مقدمه
سیتوکینز غیر قرینه میکروسپورهاي کلزا پس از اولین مراحل رشد و نمو خاصی ممکن است 10) و .(11
تقسیم میتوز دانه گرده، یک سلول رویشی بزرگ با یک محققین (22) نشان داده اند که در کشتهاي میکروسپوري
هسته حاوي کروماتین پراکنده و یک سلول زایشی کوچک که تقریباٌ 20 درصد از میکروسپورها به طرف رویان رشد و
با کروماتین فشرده ایجاد می کند. سلول زایشی سپس نمو پیدا می کنند، نسبت بالایی از میکروسپورها در مرحله
تقسیم شده و دو سلول اسپرماتوزوئید را در دانه گرده سه تک هسته اي انتهایی یا در حال تقسیم و یا ابتداي دو
سلولی ایجاد می کند 22) و .(24 میکروسپور تحت هسته اي می باشند. گزارشات متفاوتی در مورد
استرس دمایی در شرایط درون شیشه اي می تواند برنامه مورفولوژي میکروسپورهاي مرحله تک هسته انتهایی در
رشد و نموي خود را به طرف رویان زایی تغییر داده و واریته هاي مختلف کلزا وجود دارند. میکروسپورهاي تک
تولید رویانهاي هاپلوئید نماید .(5) در بیشتر گونه هاي هسته اي انتهایی کلزا در واریته وستار (Westar) حاوي
گیاهی تغییر برنامه میکروسپور براي رویان زایی تنها در ذرات نشاسته و تعداد زیادي واکوئل خیلی کوچک بود
88
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
(16)، در حالی که میکروسپورهاي واریته تاور (Tower)
(12) و واریته توپاس (22) (Topaz) در این مرحله رشد و نمو فاقد هر گونه نشاسته و واکوئل کوچکی بودند.
مطالعات دیگر با واریته توپاس (24) نشان دادند که یک واکوئل بزرگ، بلافاصله قبل از اولین تقسیم میتوز گرده از نظر اندازه کوچک شد و این واکوئل در میکروسپور هاي دو هسته اي نیز حضور داشت. همچنین این محققین در سالهاي (24) 1990 و (25) 1991 با مطالعه بر روي رقم توپاس نشان دادند که رویانهاي میکروسپوري از میکروسپورهاي مرحله تک هسته اي انتهایی واکوئل دار منشاء گرفته اند. در کلزا، که به عنوان یک گیاه مدل در القاي رویان زایی میکروسپور مطرح می باشد، حداقل 8
ساعت تیمار دمایی در دماي 32 درجه سانتی گراد لازم است تا مسیر رشد و نموي میکروسپورها به طرف رویان زایی تغییر نماید .(7) این تغییر برنامه میکروسپورها با یک سري تغییرات مشخص همراه است که فعالیتهاي مختلف سلولی و سازماندهی ساختاري اجزاي داخل سلول را تحت تأثیر قرار می دهد و این تغییرات می توانند به عنوان نشانگرهایی براي فرآیند رویان زایی میکروسپور در نظر گرفته شوند 4)، 19 و .(23 بعد از اعمال استرس القایی در شرایط درون شیشه اي، بعضی از میکروسپورها به طرف مسیر رویان زایی می روند در حالی که بعضی دیگر به تیمار استرس القایی حساس نبوده و مسیر هاي رشد و نموي مختلفی را در پیش می گیرند. اگر کشت میکروسپورها در دماي 18 درجه سانتی گراد انجام شود میکروسپورها مسیر رشد و نموي گامتوفیتی را در پیش می گیرند .(7) چندین مطالعه، جنبه هاي مختلف مسیر رشد و نمو رویان زاي میکروسپورها را در شرایط استرس مورد بررسی قرار داده اند 19)، 20 و (21، اما توجه کمی به دیگر مسیر هاي رشد و نموي میکروسپورها در شرایط درون شیشه اي، تحت هر دو شرایط القایی و غیر القایی شده است. در تحقیق حاضر، تغییرات ساختاري میکروسپورهایی که به طرف مسیر رویان زایی کلید می
خورند و همچنین دیگر مسیرهاي رشد و نموي میکروسپورها در شرایط درون شیشه اي با مسیر رشد و نموي گامتوفیتی در شرایط درون شیشه اي و برون شیشه اي (in vivo) با استفاده از مشاهدات میکروسکوپ الکترونی مقایسه شده و تفاوتهاي موجود در اندازه و شکل سلولی، معماري هسته، تجمع نشاسته و حضور واکوئلها جهت شناسایی مراحل متوالی مسیر رویان زایی میکروسپورها و مسیر هاي رشد و نموي دیگر مورد بررسی قرار می گیرند.
مواد و روشها
شرایط رشد گیاهان مادري: این آزمایش در مؤسسه
حفاظت و بهبود کشت و تنوع زیستی دانشگاه پلی
تکنیک والنسیا در کشور اسپانیا انجام گردید. رقم کلزاي بهاره پی اف (Brassica napus L. cv. PF704) که در آزمایشات رویان زایی میکروسپور نتایج بسیار خوبی نشان داده بود 1)و (2، در بررسی مکانیسم رویان زایی میکروسپورهاي کلزا با میکروسکوپ الکترونی مورد استفاده قرار گرفت. گیاهان مادري در اتاق رشدي با 5500
لوکس (300 Em- 2S-1) نور و فتوپریود ) 16 / 8 h
تاریکی/ روشنایی ) با دماي 15 / 10 درجه سانتی گراد (
شب / روز )رشد کردند.
کشت میکروسپور : کشت میکروسپور با روش عبداللهی و همکاران 1)و (2 انجام گردید. بدین ترتیب که 100 عدد غنچه با اندازه 3/5ـ2/5 میلیمتري، حاوي میکروسپورهاي رویان زا ، از گیاهان کشت شده در اتاق رشد in vivo
انتخاب گردیدند. این غنچه ها با سدیم هیپوکلریت 5/25
درصد ( وایتکس ) به مدت 10 دقیقه، ضد عفونی شدند و سپس دو مرتبه با آب مقطر سترون و سرد شده در دماي 4
درجه سانتی گراد ، هر مرتبه به مدت 5 دقیقه، شستشو داده شد. غنچههاي سترون شده توسط یک آسیاب حاوي ml
30 محیط جداسازي میکروسپورها (8) طی 3 مرتبه 10
ثانیهاي آسیاب شد. سوسپانسیون حاصل از آسیاب کردن
89
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
غنچهها، به ترتیب از دو الک آزمایشگاهی با سوراخهایی به قطر 106 و 53 میکرومتر که بر روي هم قرار داشتند، عبور داده شد. در مرحله بعد، سوسپانسیون میکروسپورها به وسیله پیپتور و پیپت برداشته شد و به لولههاي سانتریفیوژ سترون 25 ml) در هر لوله) منتقل شدند. سپس این لولهها به سانتریفیوژ منتقل گردیدند. دستگاه سانتریفیوژ روي 1270 rpm دور در دقیقه یا 200 g تنظیم گردید و زمان آن روي 4 دقیقه قرار داده شد. پس از اتمام 4 دقیقه اول، لوله هاي سانتریفیوژ از دستگاه خارج گردیدند و به زیر لامینار ایرفلو منتقل شدند. میکروسپورها در ته لولهها رسوب کردند و محلول جداسازي به همراه مواد زائد در بالا قرار گرفت که این محلول به وسیله پیپت حذف شد و مجدداً به هر لوله، 25 ml محلول جداسازي جدید اضافه گردید. این عمل 3 مرتبه تکرار گردید. سپس تراکم میکروسپورها روي 40000 میکروسپور در هر میلی لیتر محیط کشت تنظیم گردید و سوسپانسیون حاوي میکروسپورها، با محیط کشت (13) NLN-13 به حجم جدید رسانده شد و سوسپانسیون حاصل در داخل پتري دیش هاي شیشه اي به ابعاد 100×15 mm، به مقدار ml
12/5، توزیع گردید و دور آنها دو لایه پارا فیلم بسته شد و به انکوباتوري با دماي 32 درجه سانتی گراد و تاریکی به مدت 2 روز منتقل شدند. بعد از 2 روز کشتها به دماي 25
درجه سانتی گراد و تاریکی منتقل شدند.
آماده سازي میکروسپورها و رویانهاي میکروسپوري
براي عکسبرداري با میکروسکوپ الکترونی: به منظور مطالعات فراساختاري میکروسپور هاي کلزا با میکروسکوپ الکترونی، نمونه هاي میکروسپوري به روش زیر تهیه شدند:
-1 تثبیت (Fixation) میکروسپورها و رویانهاي حاصل از کشت میکروسپور در مراحل مختلف رشد و نمو
در این مرحله میکروسپورهاي کشت شده در روزهاي 1، 3، 5، 7 و 10 روز بعد از کشت میکروسپور با استفاده از
سانتریفیوژ از محیط کشت مربوطه استخراج گردیدند و سپس میکروسپورهاي استخراج شده و رویانهاي حاصل از کشت میکروسپور در مراحل مختلف رشد و نمو در محلول تثبیت کننده کارنووسکی (Karnovsky fixative)شامل پارافرمالدهید 4 (paraformaldehyde)
درصد و گلوتارالدهید 5 (glutaraldehyde) درصد در محلول کاکودیلیت 0/025 (cacodylate) مولار با اسیدیته
7/3 به مدت 2 ساعت تثبیت گردیدند. سپس نمونه هاي میکروسپوري به مدت 1 ساعت دوباره در محلول 1 درصد اسمیوم تتروکسید((osmium tetroxide تثبیت شدند.
-2 آبگیري نمونه هاي میکروسپوري و رویانها
(Dehydration) در اولین روز با استفاده از سریهاي استون به صورت زیر انجام شد.
الف- استون 30 درصد به مدت 2 ساعت، ب- استون 50
درصد به مدت 3 ساعت، ج- استون 70 درصد به مدت
2/5 ساعت و د- در نهایت استون 100 درصد در سراسر شب
-3 تیمار نمونه ها با سریهاي استون و اپون در روز دوم به شرح زیر انجام گرفت:
الف- استون 100 درصد به مدت 4 ساعت، ب- تیمار نمونه ها با محلول استون- پروپیلن اکسید 50- 50)
درصد) به مدت 5 دقیقه، ج- تیمار با پروپیلن اکسید 100
درصد به مدت 30 دقیقه و د- تیمار با استون %100 (سه بار هر دفعه 5 دقیقه)، ذ- تیمار نمونه ها با محلول استون-
اپون 10- 90) درصد) به مدت 6 ساعت، ر- تیمار با محلول استون-اپون 25-75) درصد) در سراسر شب
-4 در روز سوم نمونه هاي میکروسپوري و رویانها در سریهاي اپون به ترتیب زیر تیمار گردیدند:
الف- اپون 50 درصد به مدت 4 ساعت، ب- اپون 75
درصد به مدت 4/5 ساعت و ج- اپون 100 درصد در سراسر طول شب
90
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
-5 در چهارمین روز نمونه ها به مدت 8/5 ساعت در اپون
(یک نوع رزین ) 100 درصد و سپس در طول شب در محلول اپون 100 درصد و سرعت دهنده (Accelerator)
قرار گرفتند.
-6 در روز پنجم نمونه ها به مدت 7/5 ساعت در محلول اپون 100 درصد حاوي سرعت دهنده (Accelerator)
قرار گرفتند.
-7 پس از انجام عمل آبگیري با سریهاي استون و اپون نمونه ها در داخل کپسولهایی از جنس پلی اتیلن گلیکول قرار گرفتند (Encapsulation) و به مدت 3 روز در دماي
60 درجه سانتی گراد به منظور عمل پلیمریزاسیون قرار گرفتند.
-8 از نمونه هاي پلیمریزه شده، برشهایی به ضخامت 0/5
میکرومتر تهیه گردید(.(Cutting
-9 در نهایت عکس برداري از برشهاي تهیه شده با میکروسکوپ الکترونی مدل Jeol 1010 EM در 80 KV
انجام گردید.
نتایج
رشد و نمو گامتوفیتی در شرایط درون شیشه اي: کشت میکروسپورها در مرحله تک هسته اي انتهایی واکوئل دار
(شکل (1 A در دماي 25 درجه سانتی گراد منجر به رشد و نمو آنها به صورت گامتوفیتی گردید، به طوریکه دو و سه روز بعد از کشت میکروسپور در دماي 25 درجه سانتی گراد ، میکروسپورها به طرف ساختار هایی مشابه با دانه گرده دو سلولی (شکل(1B و سه سلولی رشد و نمو پیدا کردند. این ساختارهاي مشابه دانه گرده، حاوي هسته رویشی، زایشی، اسپرماتوزوئید ها و سیتوپلاسم متراکم بودند. ساختارهاي چند سلولی یا رویانها در این کشتها مشاهده نشدند. در نواحی خاصی از سیتوپلاسم این دانه هاي گرده کشت شده، تجمعی از دانه هاي نشاسته مشاهده گردید (شکل .(1C در سطح فراساختاري، تعداد بی شماري آمیلوپلاست بزرگ حاوي دانه هاي نشاسته
(شکل (1C در سیتوپلاسم این گرده هاي رشد و نمو پیدا کرده درشرایط درون شیشه اي مشاهده گردید.
شکل -1 کشت میکروسپورهاي کلزا در دماي 25 درجه سانتی گراد که منجر به رشد و نمو آنها به صورت گامتوفیتی گردید، (A یک میکروسپور مناسب براي رویان زایی که در مرحله تک هسته اي انتهایی حاوي یک واکوئل بزرگ است، (B رشد و نمو گامتوفیتی یک میکروسپور دوسلولی با تقسیم غیر قرینه حاوي سلول رویشی و زایشی که در دماي 25 درجه سانتی گراد (شرایط غیر رویان زا) کشت شده است، (C رشد و نمو شبه گامتوفیتی یک میکروسپور غیر رویان زاي کشت شده در دماي 25 درجه سانتی گراد که با تجمع نشاسته در سیتوپلاسم همراه است. (V) واکوئل بزرگ، (Nu) هستک بزرگ، (E) اگزین، (VN) هسته رویشی، (GN) هسته زایشی، (S) نشاسته
رشد و نمو میکروسپورها در شرایط درون شیشه اي در دماي 32 درجه سانتی گراد (حداقل به مدت 8 ساعت)،
تحت استرس دمایی: در کشتهاي میکروسپور انکوبه شده مخلوطی از مسیر هاي رشد و نموي متفاوت مشاهده
91
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
گردید (شکل .(2A-C تعداد زیادي از میکروسپورها یک میکروسپورهاي توسعه یافته در شرایط 25 درجه سانتی
برنامه رشد و نموي رویان زاي را آغاز کردند اما این گراد بودند. در این کشتها هیچ دانه گرده دو سلولی یا سه
میکروسپور ها علی رغم داشتن یک سازماندهی ساختاري، سلولی در میان ساختارهاي غیر رویان زا مشاهده نگردید و
شباهتهایی با رشد و نمو گامتوفیتی در شرایط درون شیشه این پدیده نشان دهنده این است که تقسیم میتوز گرده در
اي نشان دادند. این میکروسپورها حاوي دانه هاي نشاسته بیشتر موارد، بعد از تیمار گرمایی متوقف گشته است.
فراوان بودند (شکل (3 و از این جنبه مشابه
