بخشی از مقاله
اثرات وابسته به دوز ملاتونين بر ظرفيت بلوغ آزمايشگاهي تخمک، لقاح آزمايشگاهي و تکوين بلاستوسيست در موش
چکيده
اهداف : با توجه به اين که ملاتونين به عنوان پاک کننده قوي راديکال هاي آزاد شناخته شده است ، اين امکان وجود دارد که ميزان بلوغ آزمايشگاهي تخمک و کيفيت جنين را نيز بهبود بخشد. اين مطالعه به منظور بررسي اثر ملاتونين بر بلوغ و لقاح تخمک ها و ميزان کليواژ و تکوين بلاستوسيت هاي موش در شرايط آزمايشگاهي طراحي شد.
مواد و روش ها: اين مطالعه تجربي در مرکز تحقيقات سلولي - ملکولي دانشگاه علوم پزشکي گيلان در سال ۱۳۸۹ انجام شد. مجموعه تخمک- کومولوس (COCs) و وزيکول زاينده (GV) از تخمدان موش هاي ماده جمع آوري شد. تخمکها به مدت ۱۸ ساعت در محيط بلوغ تامين شده با دوزهاي مختلف ملاتونين (۱۰۰،۱۰، ۱ ميکرومولار و ۱۰۰، ۱۰ نانومولار) و گروه کنترل ، کشت داده شدند و ميزان بلوغ آنها مورد ارزيابي قرار گرفت .
همچنين جنين هاي دو پيش هسته اي حاصل از لقاح آزمايشگاهي در محيط T٦ تامين شده با دوزهاي مختلف ملاتونين کشت داده شدند و ميزان تکوين جنين ها تا مرحله بلاستوسيست با استفاده از ميکروسکوپ معکوس مورد بررسي قرار گرفت . نتايج با استفاده از آزمون مجذور کاي به کمک نرم افزار ١٣ SPSS تحليل شد.
يافته ها: غلظت هاي ۱، ۱۰ و ۱۰۰ ميکرومولار ملاتونين اثرات مثبتي بر ميزان بلوغ و لقاح آزمايشگاهي تخمکها در مقايسه با گروه کنترل نشان داد همچنين ميزان کليواژ و تکوين بلاستوسيست در گروه هاي تيمار شده با دوز نانومولار (۱۰۰ و ۱۰) افزايش يافت
نتيجه گيري : به نظر مي رسد ملاتونين به عنوان پاک کننده قوي نمونه هاي فعال اکسيژن ، تاثير مثبتي در بهبود بلوغ ، لقاح و تکوين آزمايشگاهي تخمکها و جنين هاي موش دارد.
کليدواژه ها: ملاتونين ، بلوغ آزمايشگاهي ، لقاح آزمايشگاهي ، بلاستوسيت
مقدمه
ازدياد تخمک گذاري ، القاي تخمک گذاري ، بلوغ آزمايشگاهي تخمک نارس ، لقاح آزمايشگاهي و انتقال جنين ، از روش هاي مهم توليدمثلي است که با استفاده از اين روش ها مي توان گام هاي بسيار مهمي در جهت توليد آزمايشگاهي جنين از تخمک و اسپرم ِ استحصال شده برداشت [۱]. همچنين مي توان از اين راه کارها در درمان ناباروري هاي انساني و دامي و حفظ حيوانات درمعرض انقراض استفاده کرد [۲].
بلوغ تخمک در شرايط آزمايشگاهي (IVM) به عنوان تکنيکي موثر در جهت کاهش قيمت و تقليل اثرات جانبي تحريکات گنادوتروپين ها در لقاح آزمايشگاهي (IVF) شناخته شده است [۳، ۴]. چانگ و تويودا بعد از جمع آوري تخمکها و آماده کردن مني [۵]، تخمکها را در محيط کشت قرار دادند، به صورتي که لقاح در شرايط آزمايشگاهي انجام شد. همچنين مطالعات ديگري در مورد جمع آوري و کشت تخمکها براي IVF در حيواناتي مانند همستر [۶] و موش [۷] و همچنين در انسان ها گزارش شده است [۸]. موفقيت در بلوغ ، لقاح و تکوين قبل از لانه گزيني جنين بستگي به يک برنامه منظم از رشد و تمايز تخمک همراه با تکوين و تمايز سلول هاي احاطه کننده فوليکول دارد.
ملاتونين (N- استيل ۵- متوکسي تريپتامين ) مهم ترين هورمون غده اپي فيز است . گزارشات نشان داده اند که هيپوتالاموس و هيپوفيز قدامي در تنظيم توليدمثل به وسيله ملاتونين نقش حياتي بازي مي کنند [۹]. راديکال هاي آزاد، نقش دوجانبه اي در مسير توليدمثل دارند و مولکول هاي کليدي سيگنالينگ براي عملکردهاي متنوع تخمدان هستند [۱۰]. به ويژه ، عملکرد سوء راديکال هاي آزاد در ريزمحيط تخمک، اسپرم و در مايع فوليکولي منجر به تغييراتي مي شود که اين تغييرات بر تکوين فوليکولي ، تخمکگذاري ، کيفيت تخمکها، ميان کنش اسپرم - تخمک، لانه گزيني و تکوين اوليه جنيني تاثير ميگذارند [۱۱].
ملاتونين به عنوان يک پاککننده قوي راديکال آزاد شناخته شده است
[۱۲]. استفاده از ملاتونين به عنوان دارو از آسيب هاي راديکال هاي آزاد جلوگيري مي کند و به عنوان يک آنتي اکسيدان فرصت هايي را براي مديريت بيماري هايي مانند سرطان ، اختلالات ايمنولوژيک، بيماري آلزايمر، ديابت ها و عفونت هاي ويروسي فراهم مي نمايد [۱۳]. مطالعات نشان داده اند که تيمار با ملاتونين ، شيوه اي موثر براي القاکردن دوره استروس و افزايش تخمکگذاري و ميزان باروري است [۱۴].
دست کاري تخمک ها و جنين ها در طول بلوغ آزمايشگاهي و لقاح آزمايشگاهي ، خطر مواجه شدن با سطوح بالايي از نمونه هاي فعال اکسيژن (ROS) را به همراه دارد، به گونه اي که آسپيره کردن تخمک ، لقاح و کشت جنين در تراکم بالاي اکسيژن مي تواند مقادير بالاتري از راديکال هاي آزاد را توليد کند. از طرفي با توجه به اين که ملاتونين به عنوان پاک کننده قوي ROS شناخته شده است [۱۲]، اين امکان وجود دارد که ميزان بلوغ آزمايشگاهي تخمک و کيفيت جنين را نيز بهبود بخشد. لازم به ذکر است که تاکنون تاثير ملاتونين بر ظرفيت بلوغ آزمايشگاهي تخمک، لقاح و تکوين بلاستوسيست هاي موش مورد بررسي قرار نگرفته است .
بنابراين هدف تحقيق حاضر، بررسي اثر ملاتونين بر بلوغ آزمايشگاهي تخمک هاي نارس و لقاح آزمايشگاهي تخمک هاي بالغ شده در شرايط آزمايشگاه و تکوين جنين ها تا مرحله بلاستوسيت بود.
مواد و روش ها
اين مطالعه تجربي در مرکز تحقيقات سلولي - ملکولي دانشگاه علوم پزشکي گيلان در سال ۱۳۸۹ انجام شد. همه مواد مصرفي به جز PMSG و Organon) HCG؛ هلند) از شرکت سيگما خريداري شدند و از موش سوري نژاد NMRI تهيه شده از انستيتوي رازي استفاده شد.
ابتدا موش هاي تهيه شده به مدت ۲ هفته در شرايط استاندارد دما، رطوبت ، تغذيه و نور (۱۲ ساعت روشنايي - ۱۲ ساعت تاريکي ) در حيوان خانه نگه داري شدند تا با شرايط محيط سازگار شوند. سپس موش هاي ماده ۸-۶هفته اي ِ مناسب که در دوره باروري بودند، انتخاب شدند. براي تحريک تخمکگذاري موش ها، ۵ واحد بين المللي PMSG به صورت داخل صفاقي تزريق شد. بعد از گذشت ۴۶ تا ۴۸ ساعت ، موش ها با جابه جايي مهره گردني کشته شدند. سپس تخمدان ها برداشته شده و بلافاصله در محيط TCM (محيط کشت بافت - ۱۹۹) گرم شده در انکوباتور که شامل FCS (سرم جنيني گوساله ) ۵% بود، قرار گرفتند. تخمدان ها با کمک سوزن انسولين کالبدشکافي شدند و مجموعه تخمک -کومولوس (COCs) و وزيکول زاينده (GV) جدا شد.
گروه هاي آزمايش : براي مطالعه اثر ملاتونين بر بلوغ آزمايشگاهي تخمک ها، تخمک هاي نارس ِ (COCs+GV) گرفته شده از تخمدان در محيط TCM حاوي دوزهاي مختلف ملاتونين قرار داده شدند و بعد از ۱۸ تا ۲۴ ساعت ميزان بلوغ تخمک ها مورد بررسي قرار گرفت .
تمام مراحل آماده سازي ملاتونين در محيط حداقل نور انجام شد.
تخمک هاي نابالغ به صورت تصادفي در گروه کنترل و گروه هاي تيمارشده با ملاتونين توزيع شدند و روند بلوغ آنها با استفاده از ميکروسکوپ معکوس مورد ارزيابي قرار گرفت .
لقاح آزمايشگاهي : موش ها با جابه جايي مهره گردني کشته شده و از دم اپيديديم آنها اسپرم گرفته شد. اسپرم ها به مدت ۱.۵-۱ ساعت در محيط T شامل BSA (آلبومين سرم گاو) ۱۵% انکوبه شدند تا استعداد لازم را به دست آورند. سپس مقدار ۱۰۶×۱اسپرم بر ميلي ليتر، در قطرات ۵۰ ميکروليتر از محيط T (شامل BSA ۱۵%) قرار داده شد و به هر قطره ۴ تا ۵ تخمک بالغ شده در محيط آزمايشگاهي اضافه شد. بعد از ۴ تا ۶ ساعت از همجواري اسپرم و تخمک ، تخمک ها در محيط تميز T شستشو داده شدند و جنين هاي دوپيش هسته اي با استفاده از ميکروسکوپ معکوس جدا شده و انکوبه شدند. ۱۸ ساعت پس از انکوباسيون ، ميزان تشکيل جنين هاي دوسلولي در هر گروه مورد بررسي قرار گرفت .
تکوين جنين ها: به منظور بررسي تاثير دوزهاي مختلف ملاتونين بر ميزان کليواژ و تشکيل بلاستوسيت ، جنين هاي دوپيش هسته اي حاصل از لقاح آزمايشگاهي ِ تخمکهاي بالغ به ۵ گروه تيمارشده با دوزهاي ۱، ۱۰ و ۱۰۰ ميکرومولار و ۱۰ و ۱۰۰ نانومولار و گروه کنترل تقسيم شدند. تعداد جنين هاي دوپيش هسته اي به دست آمده از لقاح آزمايشگاهي در جدول ۱ آمده است . سپس تکوين جنين تا مرحله بلاستوسيست مورد مطالعه قرار گرفت .
اطلاعات مربوط به همه گروه ها جمع آوري شد و نتايج با استفاده از آزمون مجذور کاي و با کمک نرم افزار ١٣ SPSS با گروه کنترل ، مقایسه و بررسی شد .
نتايج
