بخشی از مقاله
چکیده
در این پژوهش اثر کنترلی استرینهای باکتریایی سودوموناس فلورسنت VUPF5 - ، F140 و - T17-4 در حضور عوامل کلاتکنندهی شیمیایی آهن - EDTA , EDDHA - ، بر شدت بیماریزایی قارچ R. solani AG3 مورد ارزیابی قرار گرفت.
براساس نتایج بهدست آمده، مشخص گردید که استرینهای باکتریایی پاسخ مشابهی به افزودن کلاتهای آهن نشان نمیدهند. در بین استرینهای مورد استفاده، بازدارندگی از بیماری، بسیار وابسته به تغییرات خاک است، به عبارتی افزودن کلاتهای آهن به خاک گلدانهای حاوی استرینهای مختلف، در مورد برخی از استرینها، باعث کاهش میزان کنترل بیماری شد. در حالت کلی از بین دو نوع کلاتکنندهی مورد استفاده، Fe-EDDHA بیشتر از Fe-EDTA باعث کاهش توان بیوکنترلی استرینهای باکتریایی شد.
مقدمه
براساس نتایج بهدست آمده، مشخص شده است که استرینهای باکتریایی پاسخ مشابهی به افزودن کلاتهای آهن و سولفات روی نشان نمیدهند. کلاتکنندههای آهن نیز با فراهم آوردن آهن قابل جذب برای باکتری مانع تولید سیدروفور در آن میشوند یا تولید آنرا به شدت کاهش میدهند
قابل توجه است که افزودن آهن در فرمهای غیرکﻻت به خاکها مخصوصا در خاکهای آهکی ایران تأثیر زیادی در فراهم آوردن آهن برای گیاه و میکرواورگانیسمهای خاک ندارد، چرا که این آهن آزاد به سرعت هیدراته شده و به صورت هیدروکسیدهای آهن رسوب می کند، لذا قابل استفاده نیست
در مورد کلات آهن Fe-EDTA نیز حالتی مشابه ایجاد میشود زیرا که پایداری این کلات در خاکهای ایران پایین است و بهسرعت قسمت اعظمی از آهن خود را از دست داده و آنرا با عناصر فلزی دیگر مثل مس و روی جایگزین میکند .
در همین راستا این تحقیق با هدف بررسی امکان کنترل بیولوژیک قارچ عامل بیماری پوسیدگی طوقه و شانکر ساقهی سیبزمینی، با استفاده از عوامل بیوکنترل باکتریایی در حضور کلاتکنندههای شیمیایی آهن نظیر EDTA - و - EDDHA در شرایط گلخانه روی بیماری مزبور انجام شده است.
مواد و روش ها قارچ عامل بیماری و عوامل بیوکنترل باکتریایی
جهت انجام این تحقیق، قارچ Rhizoctonia solani AG-3 از کلکسیون آزمایشگاه قارچشناسی و استرینهای باکتریایی متعلق به جنس Pseudomonas از کلکسیون آزمایشگاه کنترل بیولوژیک گروه گیاهپزشکی دانشگاه ولیعصر - عج - تهیه گردید.
رقم سیبزمینی مورد استفاده
از غدهی سیبزمینی رقم مارفونا، با توجه به حساسیت بالای آن در مقابل بیماری شانکر طوقه و ساقهی سیبزمینی - پوزشیمیاب و همکاران، - 1383، تهیه شده از شرکت "فرادشت کروچ" اصفهان، استفاده گردید.
عوامل کلات کننده ی شیمیایی
در راستای انجام این تحقیق، از عوامل کلات کنندهی EDTA و EDDHA که بهصورت کلات شده با آهن و به فرم پودر Fe-EDTA و Fe-EDDHA بودند، استفاده شد. بدین منظور به ازای هر گلدان 3 کیلویی، به میزان 2 گرم از این کلاتکنندهها، بهصورت حل شده در آب آبیاری، به تیمارهای مورد نظر افزوده شدند.
تهیهی مایهی تلقیح جدایهی عامل بیماریزای قارچی
برای تهیهی مایهی تلقیح جدایهی عامل بیماریزا، از بذور جو استفاده شد. حدود 500 cm3 از بذور جو و 300 ml آب در داخل ارلن مایرهای 1 لیتری ریخته شدند و پس از نگهداری آنها به مدت 24 ساعت، برای از بین بردن میکروارگانیسمهای موجود بر سطح و شیار بذور، دوبار و هر بار به مدت یک ساعت در دمای 121° C و فشار 1/5 اتمسفر در اتوکلاو، سترون شدند ، پس از سرد شدن محیط، حلقههای 5 mm از حاشیهی پرگنهی 7 روزه قارچ در محیط کشت PDA، به داخل ارلنها منتقل و در دمای 24C° به مدت 20 روز نگهداری شدند. در این روش علاوه بر اینکه مایه ی قارچ تهیه میشد، با از دست رفتن رطوبت بذرها و نگهداری در دمای پایین ، جدایهی عامل بیماریزا برای مدت طولانی قابل نگهداری بود.
اثبات بیماریزایی جدایهی قارچی مورد استفاده
برای اثبات بیماریزایی از روش باندی1 و همکاران با کمی تغییر - Bandy et al.,1998 - ، بهشرح زیر استفاده گردید: بعد از تهیهی غدههای رقم مورد نظر و ضد عفونی سطحی آنها توسط هیپوکلریت سدیم %2 به مدت 1 دقیقه، در گلدانهای حاوی خاک سترون، کاشته شدند و چهار قطعه به قطر 5 mm از حاشیهی پرگنهی 7 روزه قارچ در میط کشت PDA، در اطراف غدهها قرار داده شدند، سپس با حدود 5 cm3 خاک استریل مرطوب پوشانده شدند. بعد از گذشت 3 هفته آبیاری مرتب، ساقهها به آرامی از خاک داخل گلدانها بیرون آورده شدند، خاک اطراف آنها شستشو داده شده و میزان ضایعهی حاصل از جدایهی قارچی روی آنها براساس سیستم درجهبندی کارلینگ و لینر2 به شرح زیر اندازهگیری گردید :
=0 هیچگونه خسارت و لکهای روی جوانه پدید نمیآید.
=1 خسارت پایین، بروز یک یا چند لکه با طول کمتر از 5 mm روی جوانه.
=2 خسارت پایین، بروز لکههای با بیش از 5 mm روی جوانه و حلقهای شدن در بعضی از جوانهها. =3 خسارت عمده، پدید آمدن لکههای بزرگ و حلقهای شدن آنها و به دنبال آن، مرگ بیشتر جوانهها. -4 از بین رفتن جوانه.
تهیه سوسپانسیون باکتریایی
تعداد 3 استرین با توانایی بالا در کنترل R. solani AG-3 تحت شرایط آزمایشگاهی انتخاب شدند. برای تهیهی سوسپانسیون مورد نظر، باکتریها از فریزر -80 درجهی سلسیوس روی محیط کشت نوترینت آگار - NA - کشت شدند. تشتک های پتری در انکوباتور با دمای 27 درجهی سلسیوس به مدت 48 ساعت قرار داده شدند. سوسپانسیون باکتریها از کشت جدید باکتریها با میزان جمعیت 3 × 1011 cfu/ml در طول موج 540 نانومتر تهیه و برای تلقیح آزمایشهای گلخانهای مورد استفاده قرار گرفت.
آزمایشهای گلخانهای
برای انجام آزمایشهای گلخانهای این پژوهش، که در گلخانهی تحقیقاتی دانشکده کشاورزی دانشگاه ولیعصر - عج - انجام گرفت، از گلدانهای سه کیلویی و خاک تهیه شده از مزارع سیبزمینیکاری که مقادیر EC و pH مناسبی برای گیاه سیبزمینی داشت pH= 8 - ، - EC= 0/5، پس از سترون شدن، استفاده گردید. پس از کاشت غدهها، استرینهای باکتریایی و همچنین کلاتکنندههای شیمیایی با اولین دور آبیاری به گلدانهای حاوی این تیمارها افزوده شدند.
نتایج و بحث
در این بررسی اثر کنترلی استرینهای باکتریایی سودوموناس فلورسنت VUPF5 - ، F140 و - T17-4 در حضور عوامل کلاتکننده ی شیمیایی آهن - EDTA , EDDHA - ، بر شدت بیماریزایی قارچ R. solani AG3 مورد ارزیابی قرار گرفت.
براساس نتایج بهدست آمده، مشخص گردید که استرینهای باکتریایی پاسخ مشابهی به افزودن کلاتهای آهن نشان نمیدهند. در بین استرینهای مورد استفاده، بازدارندگی از بیماری، بسیار وابسته به تغییرات خاک است، به عبارتی افزودن کلاتهای آهن به خاک گلدانهای حاوی استرینهای مختلف، در مورد برخی از استرینها، باعث کاهش میزان کنترل بیماری شد - شکل . - 1 در حالت کلی از بین دو نوع کلاتکنندهی مورد استفاده، Fe-EDDHA بیشتر از Fe-EDTA باعث کاهش توان بیوکنترلی شد.
بیشتر ارگانیسمهای هوازی یک استراتژی فعال را برای جذب آهن توسعه دادهاند، برای باکتریها این استراتژی بر پایهی تولید سیدروفور است
نتایج کاربرد عناصر نشان داده است که غلظت بالای آهن محیط، باعث بازداری کامل از تولید سیدروفور در باکتریها میشود. همچنین مطالعات مولکولی مشخص کرده است که بیان ژنهای تولید سیدروفور، تحت تنظیم میزان آهن محیط است، بنابراین افزودن آهن به محیط، نیاز به تولید سیدروفور را در باکتری برطرف مینماید
بررسیهای انجام شده در مطالعات "مقاومت سیستمیک القایی " - ISR - مشخص کرده است که استرینهای سودوموناس، زمانی که آهن قابل جذب پایین است، شدت بیماری را به نسبت زیادی کاهش میدهند. همچنین نتایج نشان داده است که ISR در سودوموناسها وابسته به میزان آهن در دسترس میباشد. بنابراین در حضور آهن بالا، فعالیت کنترلی این باکتریها کاهش مییابد، همچنین مشخص شده است که تولید سیدروفور، وابسته به فعالیت ISR است . - Saikia et al ., 2005 - کلاتکنندههای آهن نیز با فراهم آوردن آهن قابل جذب برای باکتری مانع تولید سیدروفور در آن میشوند یا تولید آنرا به شدت کاهش میدهند
اما نتیجهی دیگری که در بخشی از این پژوهش حاصل شد، عدم کاهش توان بیوکنترلی استرین در حضور کلاتکنندهی EDTA و همچنین عدم کاهش توان بیوکنترلی استرین VUPF5 در حضور هر دو کلاتکنندهی EDDHA و EDTA بود - شکل - 2، این با یافتههای گراهام و وب - 1991 - 1 مطابقت داشت، زیرا آنها اشاره کردند که آهن میتواند سنتز آنتیبیوتیکهای قارچی توسط باکتریهای خاک را تحریک نماید و همچنین تولید سیدروفورها برای آهن، تنها مکانیسم محدود کنندهی رشد قارچ های پارازیت نیست،
بنابراین به نظر میرسد که مکانیسمهای کنترلی این استرینها صرفاً وابسته به تولید سیدروفور نباشد، و همچنین با توجه به اینکه خاک مورد استفاده در این آزمایش ماهیت قلیایی داشت - pH=8 - و از آنجایی هم که EDTA مختص خاکهای اسیدیاست و عموماً در pH قلیایی به صورت رسوب درآمده و تا حدودی غیر قابل استفاده میشود Schroeder, 1984 - - ، بنابراین میتوان چنین استدلال کرد که یکی دیگر از دلایل عدم کاهش توان بیوکنترلی در حضور کلاتکننده مزبور، این عامل بوده باشد.
نمودار :1 شدت بیماریزایی R . solani AG3 در تعامل استرینهای باکتریایی با عوامل کلاتکننده شیمیایی
