بخشی از مقاله
چکیده
ریحان یکی از مهمترین گیاهان دارویی متعلق به خانواده نعناعیان و سرشار از ترکیبات فنیل پروپانوئیدي است. تنش هاي محیطی مانند خشکی میتوانند بر میزان بیان ژن هاي کلیدي دخیل در سنتز فنیل پروپانوئیدها تاثیر بگذارند. آنزیمهاي فنیل آلانین آمونیالیاز - PAL - و کافئیک -oمتیل ترانسفراز - COMT - از جمله آنزیمهاي مهمی هستند که در واکنشهاي اصلی متابولیسم فنیل پروپانوئیدها درگیر هستند و باعث تولید ترکیبات متنوعی از طریق مسیرهاي مختلف میشوند.
به منظور ارزیابی اثر تنش خشکی بر بیان ژنهاي کد کننده این آنزیمها در رقم کشکنی لولوي ریحان، آزمایشی به صورت گلدانی در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار در گلخانه اجرا شد. تیمارهاي خشکی شامل سه سطح 100 - کنترل - ، 75 و50 درصد ظرفیت زراعی بود. میزان بیان این ژن ها با استفاده از Real time PCR به روش سایبرگرین بررسی شد. تجزیه دادههايمرتبط با بیان ژنهاي مورد مطالعه نشان داد که در اثر تنش خشکی، بیان ژن هاي PAL و COMT در هر دو تیمار نسبت به شاهد، تغییر چندانی نداشته و پیشنهاد میشود اثر تنش خشکی و سایر تنشها بر بیان سایر ژنهاي دخیل در بیوسنتز فنیل پروپانوئیدها مطالعه شود.
مقدمه
ریحان همانند سایر گیاهان خانواده نعناعیان چون نعناع، مریم گلی، مرزنجوش و آویشن به علت اسانسی که تولید می کند، به طور وسیعی کشت می شوند . - 3 - پیکر رویشی ریحان حاوي ویتامین B، C و مواد تلخ می باشد و براي معالجه نفخ شکم و کمک به هضم غذا و مداواي بزرگ شدن طحال میتوان از آن استفاده کرد . - 5 - اسانس این گیاه و مخصوصاً ترکیبات فنیل پروپانوئیدي به عنوان ترکیبات اصلی دارویی این گیاه شناخته شدهاند
مقدار اسانس با توجه به شرایط اقلیمی محل رویش متفاوت و بین 0/5 و 1/5 درصد است. ریحان بهطور تجاري در کشورهاي فرانسه، مجارستان، آمریکا - کالیفرنیا - ، هند، اسپانیا، مصر، پاکستان، اندونزي، مراکش و تقریباً در تمام مناطق گرم و معتدل کشت و کار میشود. عوامل محیطی باعث تغییرات در رشد گیاهان دارویی شده و نیز در مقدار و کیفیت مواد موثره آنها نظیر آلکالوئیدها، استروئیدها و روغن هاي فرار - اسانس ها - تاثیر دارند.
امروزه مشخص شده است که تنش خشکی همیشه به طور کامل مضر نیست و گزارشهایی مبنی بر تاثیر مثبت آن بر ساخت مواد موثره ي گیاهان دارویی و معطر وجود دارد . - 5 - شواهد زیادي نشان میدهد که تحت شرایط تنش تولید برخی از متابولیتهاي ثانویه تا چندین برابر افزایش مییابد، اما دلایل زیادي نیز وجود دارد که این تاثیر همیشگی نیست. در موارد زیادي نیز کاهش متابولیتهاي ثانویه در شرایط تنش دیده شده است .لذا هدف از این پژوهش مطالعه تاثیر تنش خشکی بر بیان ژنهاي کد کننده آنزیمهاي فنیل آلانین آمونیالیاز - PAL - و کافئیک -oمتیل ترانسفراز - COMT - به منظور افزایش میزان ترکیبات مهم فنیل پروپانوئیدي در ریحان بود.
مواد و روشها
به منظور بررسی تاثیر تنش خشکی بر بر بیان ژن هاي PAL و COMT در رقم کشکنی لولوي ریحان، آزمایشی به صورت گلدانی در سال 1393 در گلخانه دانشکده کشاورزي دانشگاه ارومیه بر پایه طرح کاملا تصادفی با سه تیمار و سه تکرار اجرا شد. پس از آماده سازي گلدانها، تعدادي بذر داخل آنها کاشته و تا رسیدن به مرحله 8-6 برگی بوتهها، بطور یکسان آبیاري شدند و از این مرحله به بعد تنش خشکی با 50، 75 و 100 - کنترل - درصد ظرفیت زراعی اعمال شد. در مرحله گلدهی کامل براي مطالعه بیان ژنهاي PAL و COMT، نمونههاي برگی از ده بوته در هر تکرار برداشت و به فریزر -80 درجه سانتیگراد منتقل شد.
توالی ژنهاي مذکور از پایگاههاي اطلاعاتی ذخیره و آغازگرهاي اختصاصی با استفاده از نرم افزارهاي Fast PCR و Gene Runner طراحی شد. استخراج RNA از نمونههاي برگی با استفاده از محلول استخراج RNX-plusTM - سیناکلون، ایران - مطابق دستورالعمل پیشنهادي شرکت سازنده با کمی تغییرات انجام شد. جهت ساخت cDNA از کیت RevertAid First Strand cDNA Synthesis - شرکت فرمنتاز، آلمان - مطابق دستوالعمل پیشنهادي شرکت سازنده استفاده شد. براي بررسی صحت ساخت cDNA از واکنشهاي کنترل منفی RT - عدم استفاده از آنزیم RT در مرحله سنتز - cDNA و NTC - عدم استفاده از RNA مورد مطالعه در مرحله سنتز - cDNA و همچنین از واکنش کنترل مثبت مطابق دستورالعمل کیت سنتز cDNA استفاده شد.
میزان بیان ژنها با استفاده از - Rotor gene Q-Pure Detection – Qiagen - Real time PCR مدل 6000 - شرکت کیاژن، آمریکا - در گیاهان تیمار شده نسبت به کنترل بررسی شد. در این فرایند از ژن 18SrRNA به عنوان ژن مرجع جهت نرمال سازي استفاده شد. براي انجام واکنش Real time PCR از کیت Maxima SYBR Green/Fluoresence qPCR Master Mix - 2x - شرکت فرمنتاز استفاده شد. دورههاي زمانی جهت تکثیر ژنهاي مورد نظر با توجه به توالی
آغازگرها و محصول
حاصل از تکثیر ژن تعیین شد. پس از انجام واکنش، منحنی ذوب - Melt curve - براي هر کدام از ژنها رسم و صحت تکثیر محصول مربوط به هر ژن با استفاده از منحنی ذوب مربوط به آن ژن و همچنین آنالیز ژل تایید شد. پس از بدست آوردن Ct، مقدار بیان نسبی ژنهاي مورد مطالعه با روش Ct محاسبه شد. براي بررسی اختلاف بین تیمارهاي تنش از لحاظ میزان نسبی بیان ژنهاي مورد مطالعه، آزمون t جفت نشده با نرم افزار SAS نسخه 9/1 انجام گرفت.
نتایج و بحث
مقایسه میزان بیان ژن PAL در تنش شدید 50 - درصد ظرفیت زراعی - و تنش متوسط 75 - درصد ظرفیت زراعی - نسبت به کنترل - بدون اعمال تنش - ، نشان داد که میزان بیان این ژن به ترتیب 1/5 و 2 برابر افزایش یافته است. لذا میتوان بیان کرد که تنش خشکی تاثیر چندانی بر میزان بیان این ژن نداشته است. مقایسه میزان بیان ژن COMT در هر دو تیمار تنش نسبت به کنترل، نشان داد که تنش 50 درصد ظرفیت مزرعهاي میزان بیان این ژن را تغییر نداده است. همچنین تنش 75 درصد ظرفیت
مزرعهاي میزان بیان این ژن را نسبت به کنترل به میزان ناچیزي 1/2 - برابر - افزایش داده است - شکل . - 1 در مطالعه اي - 6 - که بر روي بیان ژنهاي PAL و C4H در پاسخ به تنش خشکی در گیاه چاي انجام شد؛ بیان این ژنها کاهش یافت. در این تحقیق تنش خشکی به صورت قطع آبیاري انجام شد که در روزهاي 4 و6 شدیدا بیان این ژنها کاهش یافته و تا روز هشتم این کاهش ادامه داشت.
در مقایسه با شرایط کنترل، میزان بیان ژن هاي PAL و C4H در روز هاي مذکور به ترتیب 61 و70 درصد کاهش نشان داد. در حالیکه در مطالعه حاضر بیان ژن PAL تحت تاثیر تنش خشکی قرار نگرفت. در مطالعهاي - 4 - اثر تنش خشکی بر بیان ژنهاي درگیر در مسیر بیوسنتز گلیسیریزین - ترپنوئید - در گیاه شیرین بیان بررسی شد؛ ارزیابی بیان ژن با استفاده نشان دا د در اثر طلاق تنش خشکی در مرحله گیاهچه و گیاه بالغ افزایش داشت در حالی که سطح بیان ژن cycloartenol synthase
شکل .1 مقایسه میانگین تاثیر سطوح مختلف تنش خشکی بر بیان نسبی ژن هاي فنیل آلانین آمونیالیاز - PAL - و کافئیک -oمتیل ترانسفراز - COMT - درگیاه ریحان :T50 - تنش خشکی 50 درصد ظرفیت زراعی و :T75 تنش خشکی 75 درصد ظرفیت زراعی. حروف متفاوت روي نمودار نشان دهنده اختلاف معنی دار در سطح 5 درصد بین تیمارها می باشد. -
