بخشی از مقاله
چکیده:
این تحقیق به منظور بررسی تأثیر فنیلآلانین، سالیسیلیکاسید و عصارهی مخمر بر روی رشد ریزنمونههای قرهقاط در کشت درون شیشهای انجام گردید. برای این منظور، ریزنمونههای تکگرهی و جوانههای انتهایی قرهقاط از مناطق جنگلی استان اردبیل تهیه و از طریق تیمار با محلول 3 g/l بنومیل، محلول - 5% - H2O2، اتانول %70 و در نهایت محلول هیپوکلریتسدیم %2/5 با pH=10 به مدت 12 دقیقه ضدعفونی شدند. ریزنمونهها روی محیط کشت MS فاقد ترکیب هورمونی و محرک رشد - شاهد - 1، محیط کشت حاوی 2 میلیگرم بر لیتر BAP و 0/1 میلیگرم بر لیتر IBA و فاقد محرکهای رشدی - شاهد - 2 و محیط کشت MS حاوی 2 میلیگرم بر لیتر BAP و 0/1 میلیگرم بر لیتر IBA به همراه محرکهای رشدی عصاره مخمر 500 - ، 1000 و - 2000، فنیلآلانین و سالیسیلیکاسید 50 - ، 100 و - 200 میلیگرم بر لیتر و همچنین محیطهای کشت حاوی اثرات متقابل دو محرکهای رشدی مختلف با یکدیگر مورد کشت قرار گرفتند. نتایج به دست آمده نشان دادند که استفاده از محرکهای رشدی فنیلآلانین و سالیسیلیکاسید تأثیر مناسبی بر میانگین تعداد برگ در هر ریزنمونه برگ داده داشتند این در حالیست که استفاده از عصارهی مخمر - به تنهایی یا در ترکیب با سایر محرکها - تأثیر مناسبی بر تعداد برگ ریزنمونههای کشت شده نداشتند. از نظر درصد ساقهزایی و درصد برگدهی و زندهمانی ریزنمونهها نیز استفاده از فنیلآلانین، سالیسیلیکاسید و ترکیب با یکدیگر و تیمار شاهد محیط MS - حاوی هورمون رشد و فاقد محرک رشد - نتایج بهتری نسبت به تیمار حاوی عصارهی مخمر داشتند، به گونهای که بهترین عملکرد از نظر درصد ساقهزایی مربوط به محیط حاوی 200 میلیگرم برلیتر فنیلآلانین و همچنین محیط حاوی 100 میلیگرم برلیتر سالیسیلیکاسید به ترتیب 63/33 - و 55/35 درصد - بود. از نظر درصد برگدهی نیز استفاده از 50 میلیگرم برلیتر فنیلآلانین نتایج بهتری 95/55 - درصد - را نشان دادند.
کلمات کلیدی: کشتدرونشیشهای، فنیلآلانین، سالیسیلیکاسید و . - Vaccinium arctostaphylos -
-1مقدمه
گیاه بلوبری1 - با نام محلی قرهقاط - - Vaccinium arctostaphylos - عضوی از خانوادهی اریکاسه2میباشد. این گیاه به صورت درختچهای به ارتفاع 1/5 متر بوده که میوه و برگهای آن دارای خواص دارویی است. میوههای گیاه قرهقاط دارای مقادیر بالایی از مواد مهمی همانند ویتامینها - غنی از ویتامین ث و ب - و همچنین ترکیبات آلی فعال با فعالیت آنتیاکسیدانی، آنتی تومور - ضد سرطان - و ضد التهاب است. - آخوندزاده، . - 1379 ریزازدیادی شاخهای از علوم کاربردی در مبانی بیوتکنولوژی گیاهی است، که سازمانهای مختلف تحقیقاتی از جمله شرکتهای کشتبافتی و شرکتهای تولیدی گیاهان پایه در سطوح مختلف و بر اساس برنامههای تحقیقاتی و درآمدزایی خود از آن بهره برداری میکنند. در روش ریزازدیاد به کمک کشت جوانه جانبی و انتهایی امکان تکثیر گیاهان کاملاٌ شبیه گیاه مادری را فراهم میکند. به عبارت دیگر کشت جوانه جانبی و انتهایی، گیاهان کلون شدهایی را در اختیار ما میگذارد. روش ریزازدیادی درونشیشهای به طور گستردهای برای تکثیر کلونال بسیاری از گونههای درختی از جمله درختان میوه و جنگلی مورد استفاده قرار گرفته است . - Gomez & Segura, 1995 - سرعت شاخهزایی کم، طویلشدگی ساقه و میزان بالای آلودگی میکروبی، از عوامل اصلی محدود کننده موفقیت در ریزازدیادی درختان می-باشد . - Diaz-sala et al., 1994 -
مؤثرترین سیستم تکثیری برای انواع گونههای جدید و قدیم گیاهان قرهقاط استفاده از ریزازدیادی است، چون به حد کافی گیاهانی با رشد سریع تولید میکنند و همچنین امکان تولید نهالهایی عاری از بیماری در این روش وجود دارد که در روشهای سنتی تولید گیاهان عاری از بیماری محال است. به این دلیل در 30 سال گذشته استفاده از سیستمهای ریزازدیادی برای تکثیر گیاه قرهقاط توسعهی فراوانی یافته است . - Fukui et al., 1991; Gonzalez et al., 2013 - در مقایسه با تکثیر معمولی - تکثیر غیرکشتبافتی - ، گیاهان قرهقاط حاصل از ریزازدیادی درونشیشهای میوههای بیشتری تولید میکنند . - ElShiekh et al., 1996 - متابولیتهای ثانوی اغلب در طی یک دوره رشد و نموی خاص در گیاه تولید میشوند. متابولیتهای ثانوی دارای عمل کردهای اکولوژیکی مهم در گیاهان هستند. این دسته از ترکیبات، در حفاظت گیاهان مقابل گیاهخواران و عوامل بیماریزای میکروبی، به عنوان جذب گرده افشانها و جانوران منتشر کننده بذر، رقابت گیاه با گیاه و همزیستی گیاه با میکروب نقش دارند . - wink, 2010 - سالیسیلیکاسید نمونهای از محرکهای طبیعی بیخطری است که به عنوان ترکیبات محرک تولید متابولیتهای ثانویه از طریق القاء تنش کاذب عمل مینماید . - Wang etal., 2009 - اسیدسالیسیلیک از ترکیبات فنلی موجود در گیاهان بوده که رشد و نمو، میزان تنفس، فتوسنتز، جذب و انتقال یونها را تحت تأثیر قرار داده و تغییراتی را در ریختشناسی برگ و ساختار کلروفیل ایجاد میکند . - Popova et al., 2003 - فنیلآلانین و تیروزین دو پیشساز رزمارینیکاسید هستند که کاربرد آنها در کشتهای سلولی میتواند به افزایش رزمارینیک منجر شود. رزمارینیکاسید از جمله متابولیتهای گیاهی دارویی است که در سالهای اخیر توجه بسیاری به آن معطوف شده است. خواص دارویی آن از قبیل اثرات مثبت آن بر آلزایمر و افسردگی بیان شده است Ramachandra,2002 - ؛ . - Ravishankar, 2000 فنیلآلانین آمونیالیاز - PAL - آنزیم اصلی در اتصال مسیر سنتزی اسیدهای آمینه آروماتیک و متابولیتهای ثانویه شامل گروه وسیعی از ترکیبات فنلی است و نقش کلیدی در تنظیم محصولات حاصل از مسیر فنیل
پروپانوئیدی ایفا میکند. در واقع PAL امکان تبدیل فنیلآلانین به ترانس اسید- سینامیک را فراهم ساخته و سبب ادامه چرخه و تولید مواد فنلی میشود . - Bagal et al., 2012 - عصاره مخمر باعث تولید سیلیمارین و ترکیبات مشابه میشود. عصاره مخمر به عنوان محرک غیرزنده عمل میکند. عصاره مخمر نیز ترکیبی از ترکیبات مختلف، آمینواسیدها، ویتامینها و ترکیبات معدنی میباشد. همچنین اثر عصاره مخمر به عنوان محرک میتواند ناشی از ترکیبات دیگری باشد که هنوز به درستی شناسایی نشدهاند . - Sandra, 2000 -
بنابراین، این تحقیق به منظور بررسی تأثیر محرکهای رشدی مختلف فنیلآلانین، سالیسیلیکاسید و عصاره مخمر و ترکیب با یکدیگر بر روی رشد ریزنمونههای گرهی گیاه قرهقاط V. arctostaphylos انجام گردید.
-2مواد و روشها
1؛-2 تهیه ریزنمونهها:
سرشاخههای تازه رشد یافته قرهقاط در فصل تابستان از مناطق جنگلی روستای سوها N0:38/25 - و E0: 48/64 و 1670متر - از توابع شهرستان اردبیل تهیه و در ابعاد نسبتا کوچکتر در بستهبندی مناسب به آزمایشگاه منتقل شدند. و با استفاده از اسکالپل تیز و تمیز به قطعات کوچکتر، ریزنمونههای حاوی تک یا دو گره برش داده شدند. سپس ریزنمونههای را به حالت معمول، ابتدا با محلول ظرفشویی به مدت 30 دقیقه شستشو داده شد. زیر آب جاری به مدت یک ساعت آبکشی شدند. و پس از غوطه ور کردن درون بنومیل g/l 3 به مدت 2 ساعت، با محلول 5% H 2O2 به مدت 10 دقیقه غوطهور شده و سپس با آب استریل به مدت 2 دقیقه شستشو داده شدند - این مرحله به دلیل ترکیب پذیری بالای H2O2 و هیپوکلریت سدیم و تأثیر مخرب بر روی سلول گیاهی الزامی است - . سپس ریزنمونهها با اتانول 70% به مدت 50 ثانیه و هیپوکلریتسدیم با pH =10 و حاوی 0%/1 Tween20 به مدت زمان 12 دقیقه، تیمار شده و پس از سه بار آبکشی با آب مقطر استریل روی محیط کشت شاهد MS - 1 فاقد ترکیب هورمونی - ، شاهد MS - 2 حاوی 2 میلیگرم بر لیتر BAP و 0/1 میلیگرم بر لیتر - IBA، محیط کشت MS حاوی 2 میلیگرم بر لیتر BAP و 0/1 میلیگرم بر لیتر IBA به همراه محرکهای رشدی عصاره مخمر 500 - ، 1000 و - 2000، فنیلآلانین 50 - ، 100 و - 200، سالیسیلیکاسید 50 - ، 100 و - 200 میلیگرم بر لیتر و اثرات متقابل نسبت به یکدیگر، کشت شدند. همه آزمایشها در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار و حداقل 10 لوله آزمایشی و در سه تکرار انجام گرفت و 6 هفته پس از کشت درصد زنده-مانی ریزنمونهها، درصد ریزنمونههای برگ داده، درصد ساقهزایی و تعداد برگ در هر ریزنمونه ثبت شد. کلیه کشتها در اتاقک رشد با دمای 25 درجه سانتیگراد و تناوب نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی با شدت نور 2900 الی 3800 لوکس نگهداری شدند. قبل از انجام تجزیه و تحلیل دادهها، تست نرمال بودن دادهها با استفاده از آزمون تک نمونهایی کولوگروف انجام گرفت. تجزیه و تحلیل دادهها با استفاده از نرمافزار SPSS16 و رسم نمودارها با استفادهاز نرمافزار EXCEL انجام گرفت.
-3 نتایج
نتایج حاصل از تجزیه دادهها نشان داد که میانگین تعداد برگ در هر ریزنمونه برگ داده، درصد ساقهزایی، درصد برگدهی و درصد زنده-مانی ریزنمونههای قرهقاط به طور معنیداری تحت تأثیر نوع محرکهای رشدی مورد استفاده درون محیط کشت قرار گرفتند. مقایسه میانگین دادهها نشان دادند که از نظر میانگین تعداد برگ در هر ریزنمونهی برگ داده بین برخی از تیمارها اختلاف معنیداری دارند - شکل 1 الف - . به طوری که استفاده از ترکیب هورمونی درون محیط کشت تأثیر زیادی بر تعداد برگها داشتند. به گونهای که در محیط فاقد ترکیب هورمونی کمترین تعداد برگ مشاهده شد 2 - عدد - . همچنین استفاده از عصارهمخمر در غلظتهای مختلف و یا در ترکیب با فنیل-آلانین یا سالیسیلیکاسید نرخ تولید برگ را میکاهد. استفاده از فنیلآلانین - به تنهایی و یا در ترکیب با سالیسیلیکاسید - تأثیر مناسبی بر
