بخشی از مقاله
چکیده
یکی از نقشهاي مهم پپتیدهاي فعال زیستی فعالیت آنتی اکسیدانی آن ها ست. سفیده تخم غاز پا زرد توسط پروتئاز پاپایین هیدرولیز شد. پپتیدهاي با وزن مولکولی کمتر از 1 kDa بوسیله اولترا فیلتراسیون جداسازي شده وسپس توسط سیستم کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا - HPLC - فرکشن ها جدا سازي شدند. فعالیت آنتی اکسیدانی هر یک از فرکشن هاي منتخب با استفاده از فعالیت حذف رادیکال DPPH و شلات کنندگی یون فلز بررسی شدند. فرکشن هاي 6، 5 و1 هر کدام به ترتیب با %38، %37 و %35 داراي بالاترین فعالیت حذف رادیکال آزاد بودند و فرکشن هاي 2 و 5 نیز هر کدام به ترتیب با %68 و %53 داراي بالاتري فعالیت شلات کنندگی بودند.
.1 مقدمه
تشکیل رادیکالهاي آزاد از قبیل رادیکال آنیونی سوپر اکسید - و رادیکال هیدروکسی - - ، در موجودات هوازي در طی فرایند تنفس یک پی آمد غیر قابل اجتناب است.[1] از بیماریهایی که به واسطه رادیکال هاي آزاد ایجاد می شود، می توان به تصلب شراین atherosclerosis - - ، دیابت ، آرتریت روماتیسمی اشاره کرد. از این گذشته سرطان نیز احتمالا ناشی از صدمات اکسیداتیو DNA است.
[3] همچنین رادیکال هاي آزاد اهمیت زیادي در صنعت غذا و در بین مصرف کننده هاي فراورده هاي غذایی دارد. زیرا چربی و روغن هایی که بواسطه رادیکال ها اکسید شده اند یکی از مهمترین دلایل افت کیفیت غذاهاي چربی دار در طی فراوري و نگهداري است.[2]پپتیدها ممکن است چندین عمل زیستی گوناگون را انجام دهند. پپتیدها براساس خصوصیات ساختاري و ترکیب و توالی آمینو اسیدهایشان نقش هاي مختلفی از قبیل شبه - مخدري ، اتصال به مواد معدنی ، ضد میکروبی ، آنتی اکسیدانی ، تعدیل کننده سیستم ایمنی ، ضد فشار خون و.... داشته باشند.[4] هدف اصلی این مطالعه بررسی خاصیت آنتی اکسیدانی پپتیدهاي فعال زیستی حاصل از هیدرولیز سفیده تخم غاز است. تاکنون هیچ گزارشی از شناسایی پپیتد هاي فعال زیستی حاصل از هضم پروتئین هاي سفیده تخم غاز دیده نشده است.
.2 مواد و روشها: .2.1مواد:
تخم غاز پازرد تازه از بازار محلی تهیه شد. پاپایین از شرکت مرك و سایر مواد شیمیایی شامل ، 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazy - DPPH - ،- - 3- - 2-pyridyl - -5,6-bis - 4-phenyl-sulfonic acid 1,2,4-triazine - ferrozine - و Fecl2 از شرکت سیگما تهیه شد.
.2.2تعیین غلظت و آماده سازي هیدرولیزات پروتئین هاي سفیده تخم غاز
براي تعیین غلظت پروتئین سفیده تخم غاز از روش تعیین غلظت پروتئین برادفورد - 1976 - با استفاده از سرم آلبومین گاوي به عنوان ماده استاندارد استفاده شد.[5] براي هیدرولیز پروتئین هاي سفیده تخم غاز از پروتئاز پاپایین - - Papain استفاده شد. ابتدا سفیده جدا شده توسط بافر فسفات 50 - میلی مولار ، - pH 6 به نسبت 5 بار رقیق شد. سفیده رقیق شده 20 دقیقه در دمايc انکوبه شد.
مخلوط واکنش هضم به نسبت 1:20 سفیده رقیق شده با پاپایین تهیه شده و در زمان هاي مختلف - -2 -1/5 -1 -0/5 8 -6 -4 -3 -2/5 ساعت - در دماي c انکوبه شد. هضم با قرار دادن هیدرولیزات در آب جوش به مدت 10 دقیقه متوقف شد.[6] براي رسوب پروتئین هاي باقی مانده هیدرولیزات 10 دقیقه با دور 8000 ، سانتریفیوژ شدند. براي جدا سازي پپتیدهاي کوچکتر از 1 kDa به روش اولترا فیلتراسیون هیدرولیزات از غشاي 1 kDa عبور داده شدند.
.2.2.2جدا سازي پپتیدها با استفاده از سیستم HPLC
فرکشن هایی که خاصیت آنتی اکسیدانی داشتند توسط سیستم HPLC فاز معکوس با ستون C18 شیب خطی - 0-50% در 50دقیقه - استو نیتریل 0/1% تري فلورو استواستیک - TFA - با سرعت جریان 2ml/min جدا سازي شدند .[1] جذب پیک ها در 214 نانومتر با استفاده از دتکتور UV اندازه گیري شد. هر یک از فرکشن هاي بدست آمده و منتخب ، فریز دراي شده و بعد از خشک شدن در 0/5 میلی لیتر آب مقطرحل شدند.
.2.3بررسی خواص آنتی اکسیدانی پپتیدهاي حاصل از هیدرولیز سفیده تخم غاز .2.3.1فعالیت حذف رادیکال DPPH
فعالیت حذف رادیکال - DPPH - براساس روش Shimada و همکاران - 1992 - با کمی تغییرات انجام شد .[ 7] ابتدا 200 µl از نمونه با 600 µl اتانول 96% مخلوط شدند و سپس - 0/ 15 mM - DPPH 200 µl به محلول اضافه شده و محلول به خوبی هم خورده و 30 دقیقه در تاریکی قرار داده شد. و بعد از گذشت این زمان جذب محلول در 517 nm توسط دتکتور UV اندازه گیري شد.براي تهیه محلول کنترل به جاي نمونه از اتانول استفاده می شود.
.2.3.2 فعالیت شلات کنندگی یون هاي فلزي
این فعالیت بر اساس روش Decker and Welch - 1990 - با کمی تغییرات اندازه گیري شد200 μΙ .[7] نمونه با 100 μΙ فروس کلراید - - 2 mM مخلوط شده و به مدت یک دقیقه خوب هم می خورد سپس 600 μΙ آب مقطر و 20 μΙ فروزین - - 5 mM به محلول اضافه شده و مجدد به مدت یک دقیقه خوب هم خورده و بعد از 10دقیقه جذب آن در 562 nm توسط دتکتور UV اندازه گیري می شود. براي تهیه محلول کنترل به جاي نمونه از آب مقطر استفاده می شود.
.3 نتایج
.3.1 تعیین بهترین زمان هضم
براي تعیین بهترین زمان هضم ، فعالیت حذف یون DPPH و شلات کنندگی یون فلز، براي هیدرولیزات زمان هضم هاي مختلف اندازه گیري شد. مطابق شکل1 بهترین زمان هضم براي هر دو نوع فعالیت 3 ساعت بدست آمد. پروتئین هاي سفیده تخم غاز توسط آنزیم پاپایین تحت شرایط بهینه هیدرولیز شده و توسط اولترافیلتراسیون پپتیدها با وزن کمتر از 1 kDa جدا شده و این پپتیدها توسط RP-HPLC خالص سازي شدند. براي فرکشن هاي منتخب و نشان داده شده در شکل 2 فعالیت حذف رادیکال DPPH و شلات کنندگی یون فلزي اندازه گیري شد.
