بخشی از مقاله
چکیده:
با توجه به اهمیت باکتریهای تجزیه کننده سلولز در فرایند تجزیه میکربی وهیدرولیز آنزیمی ضایعات آلی مقاوم به تجزیه تحقیقی به منظور جداسازی و خالص سازی باکتریهای سلولولیتیک از موریانه در موسسه تحقیقات خاک و آب انجام شد. رقتهای مختلف روی محیط باسیلوس آگار برده شد و بر اساس مرفولوژی و ظاهرکلونیهای باکتری تعداد 12 جدایه باکتری جداسازی و برای بررسی سلولولیتیک بودن روی محیط کشت حاوی کربوکسی متیل سلولز - BHM - ابتدا کشت خطی و سپس نقطهای انجام شد. بر اساس میزان فعالیت آنزیم سلولازی و قطر هاله و کلنی ابتدا هفت جدایه و پس از اندازه گیری آنزیمهای سه گانه سلولازی و بر اساس حداکثر فعالیت آنزیمی تعداد چهار جدایه برتر تفکیک شد در نهایت برترین سویه باکتری از نظر تولید هر سه آنزیم سلولازی با نام اختصاری NTT که حاوی 1038/6میکروگرم گلوکز در میلی لیترعصاره آنزیمی بود با نام شناسایی شد.
کلمات کلیدی: ضایعات لیگنوسلولزی خرما،سلولولیتیک،باکتری
مقدمه:
تولید ضایعات آلی در طبیعت روز به روز در حال افزایش است حال آنکه خاکها به دلیل کشتهای ی متراکم و شرایط آب و هوایی ماده آلی خود را از دست می دهند.این موضوع منجر شده که بحث تبدیل ضایعات آلی به مواد اصلاح کننده خاک و کمپوستها تحت تاثیر فعالیت گروهی از میکروبها مطرح باشد. - - - Massiani & Domeizel,1996 بر اساس گزارش گروه اقتصاد و آمار وزارت جهاد کشاورزی سالانه مجموع بقایا و ضایعات کشاورزی بالغ بر 30 میلیون تن است یکی از معضلات ضایعات خشبی ،الیاف خرما و باگاس نیشکراین است که در مدت زمان طولانی تجزیه و پوسیده شده و به کمپوست تبدیل می شود.با در اختیار داشتن اطلاعات لازم در مورد باکتریهای تجزیه کننده - سلولولیتیک - ضایعات غنی از لیگنین ،لیگنو سلولز و سلولز می توان از عملکرد این با کتریها کمک گرفت و ضایعاتی که در عرصه تولید به عنوان یک معضل مطرح است را با حداقل هزینه به کود آلی به عنوان جایگزین مناسب کود شیمیایی وارداتی و با کمترین آلودگی زیست محیطی تبدیل و از خروج ارز نیز از کشور جلوگیری کرد.
تجزیه سلولز و استفاده از آن در چرخه منابع کربن دار اهمیت دارد. سیستم گوارش موریانه ها حاوی میکربهای همزیست زیادی از جمله انواع باکتریهای هوازی و بی هوازی است که قادر به ترشح آنزیم سلولاز و تجزیه ترکیبات لیگنوسلولز می باشد به واسطه وجود این میکربها در بدن موریانه تبدیل ضایعات و معدنی کردن ترکیبات بیوپلیمری از جمله چوب اتفاق می افتد. - - Wenzel et al., 2002 طیف وسیعی از میکربهای جدید سلولولیتیک با کاربرد صنعتی در بدن موریانه موجود است. - Tokuda et al., 2004 - هیدرولیز سلولز به عنوان منبع انرژی تجدید پذیر از نظر تحقیقاتی و صنعتی مورد توجه می باشد. تحت تاثیر فعالیت آنزیمی سلولز گلوکز تولید می شود که برای تولید اتانول ،اسیدهای آلی و دیگر ترکیبات شیمیایی استفاده می شود. - Khan etal.,2002 - آنزیمهای سلولازی عمدتا به وسیله منابع میکربی از قبیل باکتریها و یوکاریوتها تولید می شود که نقش کاتالیزوری سلولز را داشته عمدتا در اثر فعالیت ورشد میکروارگانیسمها روی مواد سلولزی تولید می شود - & Lee - Koo , 2001
هیدرولیز آنزیمی کامل سلولز نیازمند انواع آنزیمهای سلولازی ازقبیل اندو گلوکاناز، اگزوگلوکاناز - اگزوسلوبیوهیدرولاز - و بتا گلوکزیداز می باشد. - - Yi JC et al.,1999 اندوگلوکاناز به طور تصادفی پیوندهای بتا یک و چهار ملکول سلولز را هیدرولیز می کند. اگزوگلوکانازها در اغلب موارد واحد سلوبیوز را از انتهای زنجیره آزاد می کند و در نهایت واحد سلوبیوز به وسیله بتا گلوکزیداز به گلوکز تبدیل می شود. - - Bhat MK, Bhat S.,1997 باسیلوس ها باکتری های هوازی و بی هوازی های اختیاری هستند که قادرند آنزیمهایشان را به محیط ترشح کنند. آنها آنزیم های هیدرولیتیک خارج سلولی را تولید می نمایند که دراکثر فرایند های صنعتی بکار گرفته می شود. سلولز پلیمری است خطی از واحد های گلوکز که با پیوند های گلیکوزیدی بتا یک و چهار به هم متصل شده اند ویکی از فراوان ترین کربوهیدرات های موجود در طبیعت می باشد به طور کلی هدف اصلی در این تحقیق دستیابی به میکروبهایی با توان بالای تجزیه مواد آلی لیگنو سلولز از قبیل ضایعات در خت خرما است که بتواند ضمن ترشح آنزیمهای سلولو لیتیک مناسب و به حد کافی سرعت تجزیه ضایعات خشبی را افزایش داده و منجر به تولید حداکثر کمپوست در حداقل زمان گردد.
مواد و روشها : -1نمونه برداری:
برای اجرای این تحقیق در ابتدا اقدام به جمع آوری تعدادی موریانه از گونه های مختلف در استانهای فارس ، خوزستان و تهران گردید و در شرایط مناسب نمونه ها برای مراحل بعد به آزمایشگاه منتقل شد. -2غربالگری - - screening باکتریهای سلولولیتیک : جهت غربالگری باکتری های توانمند ابتدا نمونه های موریانه تازه و زنده که در شرایط مناسب نگهداری شده بود را برداشته و پس از ضدعفونی کردن سطح بدن آنها با الکل 970 درصد محتویات شکمی آنها جداشده و پس از له کردن محتویات اقدام به تهیه عصاره با نسبت یک به 10 با سرم فیزیولوژیک - کلرور سدیم0/85درصد - در ارلن 250 میلی لیتر گردید و به مدت 20 دقیقه روی شیکر با دور 130 قرار داده شد. سپس ازنمونه های سری رقت از سوسپانسیون آماده شده تهیه شد و هریک از رقتها بر روی محیط کشتاختصاصی های مدیا باسیلوس آگار استریل برای تفکیک جدایه های باکتری به ویژه باسیلوس برده شد. محیط کشت باسیلوس آگار شامل 13 گرم آگار در یک لیتر آب مقطر سپس اتوکلاو در دمای 121 به مدت 15 دقیقه و در نهایت افزودن 49/2 گرم محیط کشت آماده استریل در زیر لامینار می باشد که پس از حرارت و حل شدن پلیت می کنیم.
-3اندازه گیری قدرت سلولازی در پلیت:
در این مرحله برای بررسی توان سلولازی جدایه ها در حضور کربوکسی متیل سلولز - C.M.C - به عنوان معیار ومبنای اولیه و استاندارد حاوی سلولز بررسی شد. جدایه های منتخب در رقتها به تفکیک روی محیط کشت معدنی موسوم به - Bushnell Haas Medium - BHMحاوی کربوکسی متیل سلولز - 10گرم در لیتر - کشت خطی شد و در دمای 37 در جه سانتیگراد به مدت 96 ساعت در انکوباتور قرار داده شد برای مشاهده هاله شفاف اطراف کلنی که بیانگر تولید سلولاز و تجزیه CMC است ابتدا با محلول کنگو رد سه دهم درصد سطح پلیت به مدت 20 دقیقه غرقاب سپس سطح پلیت با محلول یک مولار کلرور سدیم غرقاب شد جدایه های که سلولولیتیک باشند هاله شفاف تولید خواهند کرد که اندازه قطر هاله و کلنی با خط کش اندازه گیری وبرترین جدایه ها برای انجام آزمایشهای بعدی انتخاب . - Teather et al.,1982 -
-4تعیین فعالیت آنزیمی جدایه ها:
برای ارزیابی فعالیت آنزیمهای سه گانه سلولازی در تعداد 12 جدایه برتر سلولولیتیک اقدام شد. برای اندازه گیری آنزیم اندو گلوکاناز با سوبسترای CMC و روش - DNSدی نیترو سالیسیلیک اسید - ،آنزیم اگزوگلوکاناز با سوبسترای آویسل و روش فنل و اسید سولفوریک، آنزیم بتا گلوکزیداز با سوبسترای سلوبیوز و استفاده از کیت گلوکز اقدام شد - - Zhang et al.,2009
نتایج و بحث :
جداسازی باکتریهای برتر تجزیه کننده سلولز:
از بررسی اولیه کلنیهای جداسازی شده از نمونه های مختلف تعداد 12 جدایه باکتریهای میله ای گرم مثبت منفی و مثبت مشاهده و کد گذاری شد. در مرحله بعد از این تعداد جدایه براساس میزان تولید آنزیم سلولاز و ایجاد هاله در محیط حاوی C.M.C تعداد هفت جدایه که قادر به تولید آنزیم سلولاز بودند تفکیک شد در مرحله بعد میزان هر یک از آنزیمهای گروه سلولازی ذکر شده در جدایه ها سنجش شد از بین این 12 جدایه سلولولیتیک براساس حداکثر قدرت آنزیمی چهار جدایه برتر تفکیک و در نهایت جدایه شماره 63 با نام اختصاری NTTبه روش16SrRNA شناسایی و با نام Bacillus methyltrophicusمعرفی شد این باکتری باسیلوس گرم مثبت و اسپوردار می باشد و حاوی هر سه آنزیم مهم سلولازی می باشد که نتایج آن در جدول یک آمده است. بر اساس نتایج جدول یک مشاهده می شود جدایه شماره 56 با نام اختصاری ATD با سه و 26 میلیمتر به ترتیب دارای بیشترین قطر کلنی و هاله بود. کوچکترین قطرکلنی جدایه شماره 63 و کمترین قطر هاله مربوط به جدایه شماره64 بود.
هر چه قدر قطر هاله بزرگتر باشد بیانگر توان تولید سلولاز بیشتر می باشد. اما مجموع تولید آنزیمهای سه گانه همیشه با قطر هاله همبستگی یکسان و مثبت ندارد به نحوی که از نظر نسبت قطر هاله به کلنی جدایه شماره 56 بیشترین نسبت و جدایه شماره 64 کمترین نسبت را داشت. بیشترین میزان آنزیم اگزوگلوکاناز مربوط به جدایه 63 بود. بیشترین مقدار آنزیم اندو گلوکاناز مربوط به جدایه 65 و بیشترین مقدار آنزیم بتا گلوکزیداز جدایه 63 بود. در مجموع بیشترین میزان هر سه آنزیم متعلق به جدایه 63 به میزان 1038/6واحد آنزیمی بود. مشاهده میشود که بیشترین مجموع سه آنزیم مربوط به جدایه NTT بود که از موریانه تهران جداسازی شد این جدایه با دارا بودن هر سه آنزیم توان بالایی در تجزیه ترکیبات لیگنوسلولزی دارد. در تحقیقات بر روی جدایه های سلولولیتیک به ندرت جدایهای با توان تولید هر سه آنزیم سلولازی گزارش شده است و در تحقیقات دیگر محققان اغلب یک یا دو آنزیم از سه آنزیم مذکور در یک باکتری را گزارش داده اند Teeri , 1997 ; , 2000 -
- Bhat
