بخشی از مقاله
چکیده
آنزیم لاکتوپراکسیداز با توجه به عملکرد دفاعی علیه گونههای مختلف میکروارگانیسمها از جمله باکتریهای مضر یکی از پروتئینهای مهم شیر محسوب می شود. جهت فعالیت این آنزیم حضور دو فاکتور دیگر به نام پراکسیدهیدروژن و یون تیوسیانات - SCN- - ضروری است. بررسی ها نشان داده است که حلال های آلی با تاثیر بر ساختار آنزیم ها بر عملکرد آنزیم ها تاثیر گذارند. در چنین محیط های آلی افزایش پایداری آنزیم و تسهیل واکنش هایی که درمحیط های آبی به سختی انجام پذیر است امکان پذیر می گردد.
هدف از این تحقیق بررسی اثر غلظتهای مختلف اتانول و متانول به عنوان دو حلال آلی پرکاربرد در بیوتکنولوژی مواد غذایی و دارویی بر فعالیت آنزیم لاکتوپراکسیداز جدا شده از شیر گاو می باشد. برای تخلیص جزئی آنزیم، ابتدا نمونههای شیر بوسیله سانتریفیوژ چربی زدایی گردید، سپس جهت رسوب کازئین شیر، pH شیر از 6 به 4/7 - نقطه ایزو الکتریک کازئین - کاهش داده شد. پس از سانتریفیوژ محلول رویی به عنوان منبع آنزیمی مورد استفاده قرار گرفت. فعالیت آنزیم با استفاده از سوبستراهای ABTS و پراکسیدهیدروژن در طول موج 412 نانومتر اندازه گیری گردید.
جهت بررسی اثر اتانول و متانول بر فعالیت آنزیم، ابتدا غلظتهای مختلف از حلالها در محیط واکنش آنزیمی اضافه و سپس فعالیت آنزیم در حضور هر یک از حلالها بررسی گردید. نتایج نشان دادند که اتانول اگرچه دارای کربن بیشتر نسبت به متانول است ولی در غلظتهای پایین - % 1- 2 - باعث فعالسازی آنزیم و افزایش عملکرد آن می گردد اما در غلظت های بالاتر باعث کاهش فعالیت آنزیم شده بطوریکه در غلظت % 10 اتانول، فعالیت آنزیم به % 48 کاهش می یابد این در حالی است که در حضور متانول هیچ اثر تحریکی در فعالیت آنزیم مشاهده نشد و فقط اثر مهاری مشاهده گردید.
مقدمه
لاکتو پراکسیداز یک آنزیم اکسید و ردوکتاز است که عامل مهم ضد میکروبی محسوب میگردد و به عنوان نگهدارنده موادغذایی و آرایشی بهداشتی کاربرد دارد. سیستم ضد میکروبی لاکتوپراکسیداز، با افزایش دو ترکیب فعال کننده تیوسیانات و پراکسیدهیدروژن اعمال میگردد. لاکتوپراکسیداز، تیوسیانات را در حضور پراکسیدهیدروژن اکسید میکند و به این ترتیب هیپوتیوسیانات با خاصیت ضدمیکروبی قوی تولید میگردد و این ترکیب با SH پروتئینهای باکتریایی پیوند برقرار کرده و اثر بازدارندگی خود را بر ویروسها، قارچها و باکتریها اعمال مینماید
استفاده از این آنزیم در صنایع غذایی و داروسازی مورد توجه است که لازمه این امر در بیشتر مواقع استفاده از حلالهای آلی است بطور کلی استفاده از آنزیمها در حلالهای آلی دارای مزایایی میباشد که شامل افزایش حلالیت سوبستراهای غیرقطبی، تغییر جهت تعادل ترمودینامیکی به سمت سنتز بجای هیدرولیز، محدود شدن واکنشهای جانبی وابسته به آب، تغییر در سوبسترا و انتخابگری کایرالیته مورد نیاز، افزایش پایداری دمایی و استفاده از آنزیم بطور مستقیم در فرآیند شیمیایی بعدی یا جدید میباشد.
با وجود این مزیتها، حلالهای آلی با جدا کردن مولکولهای آب پروتئین، باعث تخریب ساختار سه بعدی و دناتوره شدن پروتئین میشوند و استفاده از آنها در محیط حلالهای آلی همواره با این چالش بزرگ همراه است .برای به کارگیری آنزیمها در حلالهای آلی لازم است که میزان فعالیت آنزیمها در حلالهای مختلف و همچنین تاثیرات آنها بر جنبههای مختلف عملکردی آنزیم مورد بررسی قرارگیرد . بدین منظور، در این تحقیق فعالیت آنزیم لاکتوپراکسیداز در حضور حلالهای آلی اتانول و متانول مورد ارزیابی قرار گرفته است.
مواد و روشکار
ابتدا نمونههای شیر گاو در دور 4000 rpm به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شده و سپس چربی شیر از آن جدا گردید. برای رسوب کازئین از روش رسوب در نقطه ایزوالکتریک استفاده شد و با توجه به این که pI یا نقطه ایزوالکتریک کازئین برابر با pH = 4/6 می باشد، pH شیر با استفاده از سود 2 نرمال به تدریج و آهسته به 4/6 کاهش داده شد. پس از رسوب کازئین شیر، نمونهها در دور 14000rpm به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ گردید و سپس محلول رویی از رسوب حاصله جدا و به عنوان منبع آنزیمی در آزمایشات مورد استفاده قرار گرفت.
جهت بررسی اثر pH های مختلف بر فعالیت آنزیم لاکتوپراکسیداز و تعیین pH بهینه آن، فعالیت آنزیم بصورت جداگانه در pH های مختلف بافر سیترات-فسفات- بورات با غلظت 0/1 M در حضور سوبستراهای ABTS و پراکسید هیدروژن اندازهگیری شد. فعالیت آنزیم در حضور حلالهای آلی با تهیه درصدهای موردنظر از حلالهای آلی اتانول و متانول در محلول سنجش آنزیمی مورد ارزیابی قرار گرفت. حلالهای مذکور به ترتیب افزایش Log P و قابل امتزاج بودن با آب و همچنین میزان بالای استفاده از آنها در زمینههای صنعتی و تحقیقاتی انتخاب شدند.
نتایج و بحث
اسنفاده از آنزیم در حضور غلظتهای مختلفی از محلولهای الکلی امروزه رشد قابل توجهی یافته است. فعالیت آنزیمها در چنین محیطهایی باعث افزایش پایداری، فعالیت یا تسهیل واکنشهایی میشود که در محیطهای آبی به سختی انجام میشوند .
در این تحقیق اثر pH های مختلف بر فعالیت آنزیم لاکتوپراکسیداز جدا شده از شیر گاو در حضور سوبسترای ABTS و پراکسید هیدروژن بررسی گردید - نمودار . - 1
نمودار : - 1 - اثر pH بر فعالیت آنزیم لاکتوپراکسیداز جدا شده از شیر گاو
همانطور که در نمودار - 1 - مشاهده میشود، محدوده pH ای که آنزیم لاکتوپراکسیداز در آن فعالیت نشان میدهد بین pH= 4 تا pH= 7/5 است. فعالیت آنزیم از pH=4 آغاز شده و با افزایش pH فعالیت تا pH= 6 به حداکثر میرسد. در pH=6/5 فعالیت آنزیم کاهش جزئی داشته در حالیکه ازpH 6/5 تا 7/5 کاهش فعالیت با شیب بسیار تندی همراه بوده بطوریکه در pH= 8 فعالیت آنزیم به صفر میرسد. بر طبق نمودار، ماکزیمم فعالیت در pH= 6 مشاهده گردید لذا pH بهینه آنزیم لاکتوپراکسیداز جدا شده از شیر گاو برابر با 6 انتخاب شد. بررسیها نشان داده است که تغییرات pH از طریق تاثیر بر روی گروههای یونیزه شونده در پروتئینها و آنزیمها و همچنین با تاثیر بر روی تشکیل یا عدم تشکیل پیوندهای یونی و هیدروژنی بر ساختار و عملکرد پروتئینها و آنزیمها موثر میباشد . - 7 - نمودارهای - 2 - و - 3 - تاثیر غلظتهای مختلف حلالهای آلی متانول و اتانول را بر فعالیت آنزیم لاکتوپراکسیداز نشان میدهد.
نمودار : - 2 - اثر حلال آلی متانول بر عملکرد آنزیم لاکتوپراکسیداز شیر گاو
طبق نمودار - 2 - افزایش تدریجی غلظت متانول باعت کاهش تدریجی در فعالیت آنزیم میگردد. برای مثال افزایش غلظت متانول از یک درصد به دو درصد باعث کاهش 12 درصدی در فعالیت آنزیم شده و در غلظت 10 درصد از متانول، فعالیت آنزیم به نصف کاهش مییابد. اما در مورد اتانول این روند متفاوت است - نمودار . - 3 در غلظتهای کم اتانول 1 - و 2 درصد - افزایش در فعالیت آنزیم لاکتوپراکسیداز مشاهده شده و سپس از میزان 5 درصد اتانول به بالا فعالیت آنزیم کاهش مییابد.
نمودار : - 3 - اثر حلال آلی اتانول بر روی عملکرد آنزیم لاکتوپراکسیداز شیر گاو
بررسی ها نشان داده است که حلالهای آلی از طریق تاثیر بر ثابت دیالکتریک محیط بر میانکنشهای الکتروستاتیک پروتئینهای تاثیر گذاشته چرا که ثابت دیالکتریک آنها با آب متفاوت است. بطور کلی کاهش خاصیت قطبی حلال و کاهش ثابت دیالکتریک سبب افزایش دافعه الکتروستاتیک شده و منجر به باز شدن پروتئینها میشود. سیمون و کورتون نشان دادهاند که حلالهای الکلی سبب تغییرات شدید در ساختمان بسیاری از آنزیمهای هیدرولیتیک شده و این تغییرات آرایش فضایی در برخی موارد می تواند باعث افزایش در فعالیت آنزیم ها گردد
همانطور که در نمودار 3 نشان داده شد اتانول در غلظتهای کم باعث افزایش فعالیت آنزیم لاکتوپراکسیداز گردید. این احتمال میرود که در معرض قرار گرفتن آنزیم لاکتوپراکسیداز با اتانول در غلظتهای کم باعث ایجاد تغییراتی در ساختمان آنزیم شده که منجر به افزایش میزان در دسترس بودن می گردد.
