بخشی از مقاله
چکیده:
مقدمه: حلال هاي آلی تمایل دارند آب را از سطح پروتئین جدا کرده و از این رو نیروهاي غیرکووالان را تخریب کرده و در نتیجه فعالیت و پایداري آنزیم را کاهش می دهند. علی رغم این موضوع استفاده از آنزیم ها در حلال هاي آلی کاربردهاي فراوانی در سنتز مولکولهاي نامتقارن زیستی دارد.
هدف: بر اساس نتایج تکامل جهت دار رزیدوهاي باردار سطحی پروتئین براي افزایش پایداري در حضور حلال هاي آلی با رزیدوهاي هیدروفوب تر جایگزین شدند.
روش کار: جهش زایی هدفمند با استفاده از روش جهش زایی quick-change روي آنزیم SVP انجام شد. وکتور pQ80L حاوي ژن پروتئاز به درون میزبان مناسب - E.coli BL21 - براي تولید پروتئاز وحشی و جهش یافته انتقال داده شد. فعالیت پروتئازي با سوبستراي FAGLA، بعنوان سوبستراي سنتزي، توسط آنزیم طبیعی و جهش یافته با کاهش جذب در 340 نانومتر اندازه گیري شد.
نتایج: در مقایسه با SVP، جهش یافته T21V پارامتر C50 نسبی را به میزان 25 و 33 درصد در حضور حلال آلی ایزوپروپانول پروپانول افزایش داده است. در حالی که جهش یافته N248G میزان این پارامتر را حدود %58 در حضور ایزوپروپانول و 55%در حضور پروپانول افزایش داده است. جهش یافته N248G میزان ki را حدود 30 - ×10-3 min-1 - در حضور ایزوپروپانول و 60 - ×10-3 min-1 - در حضور پروپانول کاهش داده است. این نتایج نشان می دهد که پیشنهاد می کند که بین افزایش هیدروفوبیسیته سطحی SVP و قدرت هیدروفوبیسیته حلال هاي آلی یک رابطه مستقیم وجود دارد.
کلمات کلیدي: حلال آلی، پروتئاز، پایداري، هیدروفوبیسیته
مقدمه
آنزیم ها در حلال هاي آلی- آبی فعالیت و پایداري خود را از دست می دهند. در محیط آبی پروتئین توسط یک قفسی از مولکول هاي آبی احاطه شده است که این لایه و یا قسمتی از آن براي عملکرد و پایداري پروتئین لازم است. جابجایی مولکول هاي آب متصل شده به پروتئین بوسیله حلال آلی یا بوسیله گرما باعث تغییر فعالیت و ساختار پروتئین خواهد بود که منجر به واسرشته شدن برگشت پذیر پروتئین می گردد. واسرشته شدن پروتئین زمانی اتفاق می افتد که مقدار مشخصی از مولکول هاي آب در لایه آبی پروتئین جابجا شوند. پس فرآیند واسرشته شدن پروتئین بیشتر وابسته به مقدار آبی است که از لایه آبی جدا می شود 1 - و. - 2
مطالعات کریستالوگرافی در حضور حلال آلی نشان دادند که قسمت اعظم مولکول هاي حلال آلی متصل به پروتئین در نواحی اطراف جایگاه فعال و در محل اتصال سوبسترا قرار دارند و بخشی از آنها در این نواحی به جایگاه هاي اتصال آب متصل می شوند - . - 3 بعنوان مثال در کریستال آنزیم سوبتیلیزین در حضور استونیتریل از کل 119 مولکول هاي حلال آلی متصل شده به پروتئین 19 مولکول حلال آلی به جایگاه هاي اتصال آب متصل شده اند. مطالعات تکامل طبیعی زیادي براي دست یابی به آنزیم هاي پایدار و فعال در برابر حلال آلی انجام شده است - . - 3 آرنولد و همکارانش از تکامل طبیعی براي مناسب کردن فعالیت یک آنزیم در محیط هاي غیر طبیعی استفاده کردند.
نتایج آنها نشان داد که جهش هاي موثر شامل افزایش رزیدوهاي قطبی و باردار می باشد که بیشتر در ناحیه لوپ هاي اطراف جایگاه فعال و در محل اتصال سوبسترا قرار دارند 2 - ،3 و . - 8 بعنوان مثال بررسی مدل ساختاري سوبتیلیزین E نشان می دهد که تجمعی از جهش هاي موثر در ناحیه اتصال به سوبسترا یا نزدیک به آن قرار دارند . با توجه به مطب فوق می توان نتیجه گرفت در صورتیکه رزیدوهاي سطحی پروتئین را با رزیدوهاي هیدروفوب تر جایگزین کنیم، می توان انتظار داشت که پایداري در برابر حلال آلی افزایش یابد. براي این منظور جهش هاي T21V، D25P، K30P و N248G طراحی و مورد بررسی قرار گرفتند - شکل. - 1
مواد و روشها ایجاد جهش: جهش زایی هدفدار با استفاده از یک پلاسمید دو رشته اي سوپرکویل داراي قطعه مورد نظر و دو پرایمراولیگونوکلئوتیدي داراي جهش موردنظر انجام شد. واکنش PCR با استفاده از محلول ذخیره با غلظت 50 پیکومول از هر پرایمر انجام شد. مخلوط واکنش شامل مواد زیر در حجم 50 میکرولیتر می باشد: - each primer; 1 µl, tempelet; 2 µl . - 5 units of PWO/µl, DW; 39 µl, 10X buffer with MgSO4; 5 µl, 10 µM dNTp; 1µl واکنش PCR با برنامه ذیل انجام گرفت: 95 °C به مدت 5 دقیقه، 22 سیکل شامل 94 °C به مدت 1 دقیقه، 55 °C به مدت 1 دقیقه و 68 °C به مدت 13 دقیقه. سپس محصول PCR بر روي ژل آگارز 1% الکتروفورز و پس از رنگ آمیزي با اتیدیوم بروماید تکثیر قطعه اي در حدود 7 کیلو باز بررسی شد. سپس ناقل بیانی pQE-80L نوترکیب حاوي ژن به میزبان بیانی آن یعنی اشریشیا کولی - - BL21 - - DE3 انتقال داده شد. در نهایت کلونی هایی که پلاسمید نوترکیب را پذیرفته اند، انتخاب و کشت داده شدند. پس از رشد باکتري ها در محیط آمپیسیلین، فرایند القاء در حضور - 100mM - IPTG و 0/0072 گرم لاکتوز به ترتیب به غلظت نهایی 1 میلی مولار و 0/4 میلی مولار، صورت گرفت . - 6 -
بررسی فعالیت پروتئازي: فعالیت پروتئازي با استفاده از سوبستراي FAGLA - N-[3- - 2-furyl - acryloyl]-glycyl-L-leucine amide - به عنوان سوبستراي سنتزي، مورد مطالعه قرار گرفت. هیدرولیز FAGLA توسط SVP و جهش یافته از طریق کاهش جذب در 345 نانومتر اندازه گیري شد. محلول واکنش - 400µl - شامل بافر تریس50 میلی مولار با pH 7 ، 5mM Cacl2 ، 0.01% Triton X-100 و50 میکرولیتر 20 میلی مولار FAGLA بود. غلظت نهایی سوبستراي حل شده در dimethylsulfoxide - DMSO - ، 2/5 میلی مولار و غلظت نهایی آنزیم نیز 20μg/ml گزارش می شود. فعالیت آنزیم درحضور حلال هاي آلی با تهیه درصدهاي مورد نظر از حلال هاي آلی DMF، متانول، ایزوپروپانول و -n پروپانول در بافر 50mM تریس در محیط واکنش مورد ارزیابی قرار گرفت. لازم به ذکر است که بعد از اضافه نمودن حلال باید pH محیط واکنش مورد ارزیابی قرار گیرد.
درصد هاي حلال آلی عبارتند از: %0، %5، %10، %20، %30، .%40 فعالیت آنزیم ها در غلظت صفر حلال هاي آلی به عنوان کنترل %100 - فعالیت - در نظر گرفته شد. منحی تغییرات فعالیت آنزیمی بر حسب غلظت هاي مختلف حلال آلی رسم گردید. غلظتی از حلال آلی که در آن % 50 فعالیت آنزیمی باقی مانده باشد، C50 نامیده می شود . - 7 - بررسی پایداري آنزیم: بررسی پایداري آنزیم در حلال هاي آلی در دماي اطاق، غلظت نهایی 40% - V/V - از حلال هاي آلی DMF، متانول، ایزوپروپانول و -n پروپانول در بافر 50 میلی مولار تریس و با pH مورد نظر تهیه شد. میکروتیوپ ها در دماي 30˚C و دور rpm 160 به مدت 15 روز انکوبه شدند. در روزهاي 0، 1، 2 ، 3 ، 4، 5، 7، 10، 12 و 15 بعد از انکوباسیون نمونه برداري شد و فعالیت باقی مانده پروتئازي مورد ارزیابی قرار گرفت. پس از تغلیظ توسط فیلتر آمیکون سوپ خارج سلولی بدست آمده، جهت تخلیص دیالیز شده و با استفاده از ستون هاي کروماتوگرافی تعویض یونی و غربال مولکولی به کمک دستگاه FPLC تخلیص شد و تحت مطالعات آنزیمی در حضور و عدم حضور حلال آلی قرار گرفتند.
نتایج و بحث
ایجاد جهش: کرامبین به عنوان پایدارترین پروتئین شناخنه شده در حلال هاي آلی و PST-01 نیز به عنوان کاراترین پروتئاز در حلال هاي آلی مطرح هستند - . - 7 آنالیز آماري رزیدوهاي سطحی کرامبین ما را به این نکته رهنمون ساخت که تعداد رزیدوهاي هیدروفوب در بیرونی ترین سطح این پروتئین بیشتر از رزیدوهاي قطبی و بار دار است - 4، 5 و. - 7 با توجه به این یافته ها، رزیدوهاي قطبی و باردار بیرونی ترین لایه پروتئین SVP با رزیدوهاي هیدروفوب تر جایگزین شدند. براي تعیین نوع جایگزینی نیز از رزیدوهاي هیدروفوب لایه هاي بیرونی این دو پروتئین مقاوم و کارا در حضور حلال هاي آلی - کرامبین و - PST-01 استفاده شد - شکل . - 1
بررسی فعالیت آنزیمی در حضور حلال هاي آلی: نتایج نشان دادند که حضور رزیدوي هیدروفوب در سطح پروتئین می تواند فعالیت آنزیم را در حضور حلال آلی افزایش دهد. به طوري که C50 جهش یافته N248G نسبت به SVP حدود 58 درصد در حضور ایزوپروپانول و 55 درصد در حضور پروپانول افزایش یافته است - جدول . - 1 جهش یافته D25P مقدار C50 نسبی را به میزان 33 و 44 درصد به ترتیب در حضور حلال آلی ایزوپروپانول و پروپانول افزایش داده است. همانطور که در جدول 1 مشاهده می شود، میزان افزایش این پارامتر در حضور حلال هاي آلی ایزوپروپانول و پروپانول بیشتر از حلال هاي آلی DMF و متانول می باشد.بررسی پایداري آنزیم ها در حضور حلال آلی و دما: غیرفعال شدن دمایی برگشت ناپذیر آنزیم وحشی و جهش یافته ها نشان می دهد که این جهش یافته ها سرعت غیرفعال شدن دمایی SVP را کاهش داده اند - شکل . - 2
