بخشی از مقاله
چکیده
شوری از عمده ترین خطرات برای تولید مطلوب گندم می باشد. در این آزمایش پاسخ الگوی بیان ژن کاتالاز و میزان آنزیم آن به تنش شوری در دو ژنوتیپ متحمل و حساس گندم تحت تیمار ده میلیگرم بر لیتر نانوذره تیتانیوم دی اکسید - TiO2 - بررسی شد. نتایج نشان داد تحت تنش شوری محتوای پراکسید هیدروژن - H2O2 - در گیاهان حساس در مقایسه با گیاهان متحمل به طور معنیداری افزایش یافت. نانو ذرات TiO2 باعث کاهش معنی داری در محتوای H2O2 شده به طوری که ژنوتیپ های متحمل، محتوای H2O2 پایین تری در مقایسه با ژنوتیپهای حساس نشان دادند. این کاهش اغلب با افزایش بیان نسبی ژن CAT و آنزیم کاتالاز به منظور محافظت از تنش شوری در ژنوتیپ متحمل در مقایسه با ژنوتیپ حساس و همچنین در گیاهان تیمار شده با نانو ذرات TiO2 در مقایسه با گیاهان شاهد همراه بود که بیانگر افزایش درجه تحمل به شوری در اثر حفاظت از سلول در برابر گونه های اکسیژن فعال بود و به توانایی گیاه گندم برای بقا و یا بهبود خسارت سلولی آن طی تنش شوری کمک میکند واحتمالاً منجر به پایداری عملکرد تحت شرایط مزرعه خواهد شد.
مقدمه
بخش زیادی از اراضی کشت گندم در مناطق شور قرار گرفته است بنابراین اصلاح برای مقاومت به شوری و رسیدن به حداکثر عملکرد هدفی مهم در برنامههای اصلاحی ملی و بینالملی است. گندم از جمله محصولات استراتژیک در کشور است که تولید و پایداری عملکرد آن از اهمیت بسزایی برخوردار است.[1] تنش شوری مانند دیگر تنش های زنده و غیر زنده با تولید بیش از حد گونههای فعال اکسیژن - - ROS باعث آسیبهای شدید از جمله تخریب پروتئین ها، دناتوره شدن آنزیم ها و شکستن مولکولهای اسید نوکلئیک در سلولهای گیاهی میشود. یکی از رویکردهای مهم در اصلاح برای تحمل به شوری بهبود پاسخهای فیزیولوژیک گیاه به تنش، بدون ایجاد تغییرات ژنتیکی است. با توجه به خواص منحصر به فرد نانوذرات تیتانیوم دی اکسیدTiO2 این نانوذره دارای بیشترین کاربرد در محصولات مختلف از جمله کرم های بهداشتی، محصولات غذایی، دارویی و کشاورزی میباشد. [2] تحقیقات گذشته نشان داده که نانوذرات TiO2 سبب تغییر در وزن خشک، سنتز کلروفیل و برخی از ویژگیهای متابولیسمی در موجودات فتوسنتز کننده شده است. این تغییراتغالباً با القای سامانههای دفاعی و کاهش قابل توجه در شاخصهای خسارت همراه بوده است .[3] بنابراین، برای کاربرد نانوذرات TiO2 ، باید نقش آنها در طی تنش شوری بیشتر مورد مطالعه قرار بگیرد. گیاهان برای دستیابی به پاسخ مناسب به تغییرات محیطی بیان بسیاری از ژنها را تغییر می دهند. کاتالاز آنزیمی مهم در مقابله با پراکسید هیدروژن به عنوان یکی از رادیکالهای آزاد اکسیژن مخرب سلولی است. تغییر در فعالیت و بیان نسبی این ژن تحت تنش شوری می تواند اطلاعات مفیدی در زمینه القای سامانه های دفاعی گیاه در سطح رونویسی و ترجمه ارائه کند. هدف از این پژوهش، مطالعه شاخصهای خسارت سلولی مانند پراکسید هیدروژن، الگوی بیان ژنCAT و فعالیت آنزیم کاتالاز تحت تنش شوری در دو ژنوتیپ گندم متحمل و حساس تیمار شده با نانو ذرات TiO2 است.
مواد و روش
در این پژوهش، از دو ژنوتیپ متحمل - کویر - و حساس - شاهپسند - استفاده شد. بذور با هیپوکلریت سدیم ده درصد ضدعفونی شده و پس از شستشو با آب مقطر بر روی کاغذ صافی در پتری دیش با رطوبت لازم که با ده میلی لیتر محلول نانوذرات TiO2 با غلظت ده میلیگرم بر لیتر تیمار شده بودند قرار گرفت. پتری دیشها در شرایط بدون نور و دمای 25 درجه سانتیگراد قرار گرفتند و پس از جوانهزنی، گیاهچهها به گلدانها انتقال یافت. محلول پاشی نانو ذره به گیاهچهها به صورت اسپری در دهمین روز در شرایط اتاقک رشد انجام شد همچنین گیاهان شاهد هر تیمار با آب مقطر محلول پاشی شدند. سوسپانسیون ده میلیگرم بر لیتر نانوذره TiO2 در آب دوبار تقطیر شده تهیه شد. جهت بررسی پاسخهای گیاهی به تنش در روز پانزدهم گیاهچههای محلول پاشی شده و شاهد به اتاقک منتقل شدند و نمونه گیری در روز اول پس از شروع تنش شوری - محلول کلرید سدیم ده درصد - و روز پنجم پس از شروع تنش شوری از هر دو گروه گیاه انجام شد. بنابراین در این پژوهش اثر نانوذره TiO2در سه نوع تیمار شوری شامل گیاهان شاهد، روز اول و روز پنجم تنش شوری و در دو ژنوتیپ متحمل و حساس در نمونه های اسپری شده و کنترل گندم و در مجموع 12 نمونه در سه تکرار به صورت آزمایش فاکتوریل در قالب طرح پایهکاملاً تصادفی مورد بررسی قرار گرفت.
به منظور استخراج و سنجش فعالیت پراکسید هیدروژن از روش لورتو و همکاران - - 2001 در طول موج 390 نانومتر استفاده شد . سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز در طول موج 240 نانومتر با استفاده از روش دیندسا و همکاران - 1981 - انجام گرفت. به منظور تکمیل اطلاعات کمی حاصل به بررسی ملکولی ژنCAT پرداخته شد و توالی آن با جستجو در بانکهای اطلاعاتی یافت شد. نمونه برگ پرچم دو ژنوتیپ گندم - کویر و شاهپسند - در تیمارهای اعمال شده در تانک ازت مایع قرار داده شده و به آزمایشگاه منتقل و در فریزر با دمای منفی 80 درجه سانتی گراد نگهداری شدند. پس از آن استخراج RNA با استفاده از کیت استخراج ستونی شرکتJena bioscience انجام و پس از تعیین کمیت و کیفیت RNA، cDNA براساس دستورالعمل کیت مربوطه ساخته شد. با استفاده از نرم افزارهایPrimer-BLAST وGene Runner و توالی mRNA ژنهای مذکور موجود در پایگاه NCBI ، آغازگر مناسب برای تکثیر ژن با روش PCR طراحی شد. برای سنجش بیان نسبی ژن از ژن خانهدار 18S rRNA بر اساس دستورالعمل آنالیز Real time qPCR انجام شد. برای هریک از سطوح تیماری سه تکرار آزمایشی و دو تکرار بیولوژیک در نظر گرفته شد. برای انجام واکنش Real time qPCR از دستگاه ROTOR GENE 3000 ساخت کشور استرالیا استفاده شد. برای استانداردسازی واکنش از پرایمرهای 18S rRNA به عنوان ژن کنترل داخلی استفاده شد. کیت Hot Taq Eva green qPCR شرکت سیناژن برای تهیه مواد واکنشReal time qPCR استفاده شد. جهت تعیین دقیق مقدار بیان ژن از روش LinReg PCR - v.2014.5 - استفاده شد .[8]
نتایج و بحث
با توجه به جدول 1 نتایج حاصل از تجزیه واریانس نشان داد که تفاوتهای معنیداری بین تیمارهای آزمایشی تحت اثر نانوذرات TiO2 از نظر صفات مورد بررسی وجود داشت و اثرات ساده رقم ، تنش و نانوذره در سطح یک درصد معنیدار اما اثرات متقابل معنیدار نیست که دلالت بر وجود تنوع ژنتیکی در بین ژنوتیپها و نیز واکنش متفاوت ژنوتیپها تحت تیمارهای شوری داشت. میزان H2O2 میتواند نشاندهنده درجه آسیب ایجاد شده توسط تنش شوری نیز باشد.[6 ] با توجه به جدول 5 مقایسه میانگین تیمارها به روش دانکن در آبیاری نرمال، تجمع H2O2 به طور معنیداری تنها در گیاهان متحمل تیمارشده با نانوذراتTiO2 در مقایسه با گیاهان شاهد کاهش یافت. در روز پنجم تنش شوری گیاهان متحمل تیمارشده با نانوذرات TiO2 کاهش معنیداری در محتوای H2O2 در مقایسه با نرمال نشان دادند درحالی که در گیاهان شاهد محتوای H2O2 تغییر معنیداری نداشت . در همین شرایط محتوای H2O2 در گیاهان حساس تیمار شده با نانوذرات TiO2 ، در مقایسه با نرمال تغییری نکرده در حالی که در گیاهان شاهد افزایش یافت - جدول . - 2 بیشترین اثر نانوذرات TiO2 بر محتوای H2O2 در ژنوتیپ متحمل مشاهده شد به طوری که محتوای H2O2 به میزان کمتری نسبت به گیاهان شاهد در روز پنجم تنش رسید. بنابراین تحت تنش شوری، نانوذرات TiO2 تنها مانع از افزایش محتوای H2O2 در ژنوتیپ حساس شد. این نتایج با نتایج مطالعه انجام شده بر روی گیاه اسفناج که نشان داده در گیاهان تیمار شده با نانوذرات TiO2 میزان تجمع ROS کاهش مییابد، مطابقت دارد. [7 ] نتایج تجزیه میزان H2O2 نشان داد که درجه پاسخ به نانوذرات TiO2میتواند وابسته به نوع ژنوتیپ در شرایط نرمال و تنش شوری متفاوت باشد که ظرفیت ژنتیکی ژرم پلاسم گندم را در پاسخ به شرایط محیطی نشان میدهد. بنابراین بررسی شاخص خسارت سلولی از یک طرف ممکن است به عنوان نشانگری آگاهی بخش در ارزیابی اثرات نانوذرات TiO2در سلولهای گیاهی مفید باشد و از طرف دیگر نشان میدهد که غلظتهای پایین نانوذره ده میلی گرم بر لیتر نه تنها سبب القا تنش اکسیداتیو نشده بلکه با کاهش میزان ROS ها، از خسارت سلولی جلوگیری میکند. به منظور مطالعه این موضوع میزان فعالیت آنزیم کاتالاز
CATبررسی شد. تحت تنش شوری فعالیت آنزیم CAT در ژنوتیپ متحمل هم در مقایسه با شرایط آبیاری نرمال و هم در مقایسه با ژنوتیپ حساس افزایش معنیداری داشت و این افزایش در گیاهان تیمار شده با نانوذره در مقایسه با گیاهان شاهد چشمگیر بود. بالاترین میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در ژنوتیپ متحمل تیمار شده با نانوذره پنج روز پس از تنش شوری مشاهده شد، همان شرایطی که میزان خسارت سلولی به کمترین میزان خود رسید - جدول - 2 چنین نتایجی حتی با مشاهده میزان فعالیت این آنزیم در گیاهان متحمل تیمارشده با نانوذره در مقایسه با گیاهان شاهد قابل انتظار بود. نتایج این پژوهش نشان می دهد که نانوذرات TiO2 نه تنها ممکن است توسط گیاه گندم جذب شوند، بلکه زمانی که گیاهان در معرض تنش شوری قرار میگیرند القا کننده اثرات مثبت بر سلول میباشند. تحت تنش شوری، نانوذرات TiO2 ، ROS های بین سلولی را که مسئول تنشهای اکسیداتیو میباشند، در فرایند سلولی وابسته به زمان کاهش می دهند. جالب است که این سازوکارها اغلب به طور متمایز در ژنوتیپهای حساس و متحمل فعالیت کرده که نشاندهنده وجود ظرفیت ژنتیکی گندم جهت افزایش تحمل شوری میباشد. القای متمایز فعالیتهای آنتیاکسیدانی در گیاهان تیمارشده با نانوذرات TiO2 احتمالا باعث کاهش محتوای H2O2 شده و میزان تحمل به شوری در گندم حساس و متحمل را افزایش داده است.
نتایج نشان داد که نانوذرات TiO2 با القای برخی از پاسخ های سلولی در طول دوره تنش شوری باعث کاهش خسارت سلولی و ارتقای سطح تحمل در گیاه گندم شد. این یافتهها که گیاه گندم تیمارشده با نانوذرات TiO2، در اثر کاهش میزان خسارتهای سلولی تحمل بیشتری به تنش شوری دارد، ممکن است به توانایی گیاه برای بقا و یا بهبود آن طی تنش بیانجامد و کاربرد جدیدی برای نانوذرات TiO2 در کشاورزی پیشنهاد کند، که منجر به پایداری عملکرد در مزرعه شود. تحقیقات گذشته نیز نشان دادهاند که نانوذرات TiO2سبب سنتز کلروفیل، تغییر در وزن خشک، عملکرد و برخی از ویژگیهای متابولیسمی موجودات فتوسنتز کننده شده که این تغییراتغالباً همراه با القای سامانههای دفاعی و کاهش قابل توجه در شاخصهای خسارت بوده است.[3 ] در بسیاری موارد افزایش فعالیت آنزیم آنتی اکسیدان سلولی تحت اثر تنش های محیطی جهت حذف رادیکالهای آزاد سلولی رخ داده و در پی تجمع رونوشتهای ژن اتفاق می افتد. به منظور مطالغه این موضوع میزان بیان نسبی ژن کاتالاز - CAT - بررسی شد. نتایج بررسی بیان نسبی CAT نشان داد که تحت تنش شوری بیان این ژن در ژنوتیپ حساس کاهش و در ژنوتیپ متحمل افزایش یافت طوری که این افزایش در گیاهان تیمار شده با نانو ذرات TiO2 معنی دار بود - شکل. - 1 در پاسخ به تنش اکسیداتیو القا شده توسط شوری ، ژن آنزیم آنتی اکسیدان کاتالاز با حذف ROS ها در هوموستازی سلول ایفای نقش می کند. افزایش میزان رونوشت ژن CAT نشان دهنده این است که گیاهان از آسیب های سلولی تنش جلوگیری کرده و تحت این شرایط گیاهان تیمار شده با نانو ذرات به طور موثرتری چنین فعالیتی را انجام می دهند.نتیجه گیری
نتایج نشان داد که نانوذرات TiO2 با القای برخی از پاسخ های سلولی در طول دوره تنش شوری باعث کاهش خسارت سلولی و ارتقای سطح تحمل در گیاه گندم شد. این یافتهها که گیاه گندم تیمارشده با نانوذرات TiO2، در اثر کاهش میزان خسارتهای سلولی تحمل بیشتری به تنش شوری دارد، ممکن است به توانایی گیاه برای بقا و یا بهبود آن طی تنش بیانجامد و کاربرد جدیدی برای نانوذرات TiO2 در کشاورزی پیشنهاد کند، که منجر به پایداری عملکرد در مزرعه شود. تحقیقات گذشته نیز نشان دادهاند که نانوذرات TiO2 سبب سنتز کلروفیل، تغییر در وزن خشک، عملکرد و برخی از ویژگیهای متابولیسمی موجودات فتوسنتز کننده شده که این تغییراتغالباً همراه با القای سامانههای دفاعی و کاهش قابل توجه در شاخصهای خسارت بوده است.
