بخشی از مقاله
مقدمه
یکی از مشکلات موجودات زنده در محیطهاي شور و الکتریکی مثل گلیسین، بتائین و دي متیل سولفونیوم
خشک، حفظ مقدار آب درونی است. گیاهان براي مقابله با پروپیونات (DMSP) می باشند 6) و .(13 تجمع پرولین در
این مشکل درسیتوپلاسم خود ترکیباتی به نام اسمولیتها را گیاهان تحت تنش، نتیجه تنظیم متقابل در دو مسیر است
انباشته می کنند. این ترکیبات باید سمی نبوده و در که روي هم رفته چرخه پرولین را تشکیل می دهد: -1
فرآیندهاي متابولیکی مداخله ننمایند و در غلظتهاي بالا افزایش بیان آنزیمهاي مسیر سنتز پرولین P5CS) ، (P5CR
ساختار و عملکرد پروتئینها را تغییر ندهند. اسمولیتها شامل -2 کاهش فعالیت تجزیه اي پرولین P5CS .(7)، آنزیم
قندهایی مثل سوکروز و فروکتوز، قندهاي الکلی مثل کلیدي در مسیر بیوسنتز پرولین در گیاهان می باشد و یک
گلیسرول و اینوزیتول متیله شده، قندهاي کمپلکس مثل آنزیم دو عملکردي است که دو گام ابتدایی در مسیر
ترهالوز، رافینوز و فروکتان، آمینواسیدهاي خاص یا بیوسنتز پرولین را کاتالیز می کند 3) و .(12 در این مطالعه
مشتقات آنها مثل پرولین و اکتوین، متابولیتهاي داراي بار با بررسی و شناسایی اپیتوپهاي سطحی آنزیم P5CS و
119
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
تولید پلی پپتید بر مبناي مطالعه اپیتوپها و تزریق آن در یک حیوان مناسب و در نهایت با استفاده از آنتی بادیهاي پلی کلنال بر علیه ژن P5CS به بررسی میزان بیان ژن P5CS
از طریق ایمونولوژیکی در گیاهچه زیتون در دو شرایط تنش وعدم تنش پرداخته شد.
مواد و روشها
گونه مورد مطالعه در این تحقیق رقم زرد زیتون با نام علمی Olea europaea می باشد که از منطقه گیلوان جمع آوري شده است.
کشت گیاه : پس از جدا کردن برون برهاي گوشتی میوه ها، میان برهاي سخت و چوبی بذرها به صورت مکانیکی شکسته شده و درون برها (رویان همراه با اندوسپرم)
جهت استریل شدن در زیر هود به مدت یک دقیقه در اتانول 70 درصد و سپس 20 تا 30 دقیقه در هیپوکلریت سدیم 50 در صد قرار داده شدند و در ادامه پنج بار شستشو با آب مقطر سترون انجام گرفت و دانه هاي سترون شده بر روي دو کاغذ صافی موجود در پتري سترون محتوي 5 میلی لیتر آب مقطر سترون شده قرار گرفته و به مدت 48 تا 72 ساعت در دماي 4 درجه سانتی گراد در تاریکی نگهداري شدند. سپس اندوسپرم ها توسط نوك اسکالپل از رویانها جدا شده و رویانهاي کامل و بدون آسیب دیدگی بر روي محیط MS با غلظت 1/2
قرار داده شدند. این محیطهاي کشت حاوي نمونه در اتاق کشت دماي 25درجه سانتی گراد و شرایط 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی نگهداري شدند. پس از گذشت 2 تا 3 هفته نیمی از رویانهاي داراي جوانه به محیط MS با غلظت 1/2 حاوي 200 میلی مولار نمک انتقال داده شدند و پس از گذشت 3 هفته از تنش شوري گیاهچه هاي سبز بعد از قطع ریشه هایشان بلافاصله به ازت مایع منتقل شدند و براي بررسیهاي بعدي در فریزر
-70 درجه سانتی گراد نگهداري شدند.
استخراج پروتئین: به روش Tsugita و همکاران (1996)
انجام شد .(16)
سنجش میزان پرولین : به میزان 100 میلی گرم برگ تازه از گیاهچه هاي تحت تنش شوري تهیه و در حضور نیتروژن مایع به صورت پودر در آمدند سپس 10 میلی لیتر اسید سولفوسالیسیلیک 3 درصد به نمونه ها اضافه شد.
محلول حاصل به مدت 10دقیقه در 13000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد و 2 میلی لیتر از محلول بالایی انتخاب شده و با 2 میلی لیتر از اسیداستیک و2 میلی لیتر محلول اسیدي نینهایدرین ( شامل 1/25 گرم نینهایدرین در 30 میلی لیتر اسید استیک که پس از حل شدن با حرارت، 20 میلی لیتر اسید اورتوفسفوریک به آن اضافه شده بود) مخلوط گردیده و به مدت یک ساعت در بن ماري 100 درجه سانتی گراد جوشانیده شد. پس از این مدت براي جلوگیري از ادامه واکنش، لوله ها در مخلوط آب و یخ قرار گرفتند. پس از رسیدن به دماي اطاق، 4 میلی لیتر تولوئن اضافه گردید و پس از به هم زدن با ورتکس شدت جذب نمونه ها در 520 نانومتر در دستگاه اسپکتروفوتومتري اندازه گیري شد وبا استفاده از مقدار پرولینهاي استاندارد وشدت جذب نوري آنها منحنی استاندارد رسم شد و میزان پرولین در گیاهچه هاي تحت تنش محاسبه گردید .(2)
تهیه آنتی بادي پلی کلنال: با توجه به نتایج حاصل از بررسی Nanjo و همکاران (11)(1999)، 15 اسید آمینه انتهاي آمین AtP5CS [EELDRSRAFARDVKR] مربوط به آرابیدوپسیس تالیانا به عنوان اپیتوپ براي سنتز آنتی بادي تعیین شد وسپس سنتزپپتید توسط شرکت سیگما انجام گردید. در ادامه 300 میکروگرم پپتید سنتز شده را در
(Phosphate buffer saline) PBS حل کرده وهم حجم آن ادجوانت کامل فروند زده و به دو ناحیه از پشت خرگوش به طریقه زیر پوستی تزریق شد. تزریق دوم یک ماه بعد انجام شد (یادآوري اول) به این صورت که 300 میکروگرم
120
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)
پپتید سنتزشده در PBS حل شد و هم حجم آن ادجوانت ناقص فروند زده وتزریق انجام شد. یادآوري دوم نیز یک ماه بعد مشابه یادآوري اول انجام شد. دو هفته بعد خونگیري انجام و سرم ( با رقت(1/1000 براي تأییدات ایمونولوژیکی تهیه گردید.
تشخیص ایجاد پادتن از طریق دات بلاتینگ : پپتید سنتز شده حکم پادگن را دارد لذا به صورت لکه هایی روي کاغذ نیتروسلولز قرار داده شد پس از تثبیت پپتید بر روي کاغذ نیتروسلولز در دماي 37 درجه سانتی گراد، از طریق دات بلاتینگ، پادتن تولید شده با پادگن واکنش داده شد.
شناسایی پروتئین مربوط به P5CS توسط پادتن از
طریق وسترن بلاتینگ : نمونه پروتئینی استخراج شده از گیاهچه تحت تنش و گیاهچه شاهد در شرایط غیر تنش بر روي ژل 12/5 در صد SDS-PAGE تزریق شد. پس از خاتمه عمل رانینگ، وسترن بلاتینگ براي شناسایی میزان بیان پروتئین مربوط به P5CS در گیاهچه زیتون در دو شرایط تنش وغیر تنش انجام گردید. آنالیز وسترن
جلد 27، شماره 1، 1393
بلاتینگ به روش Nanjo و همکاران (1999) انجام شد
.(11)
تجزیه و تحلیل آماري داده ها: داده ها با استفاده از تست آنووا وآزمون دانکن مورد بررسی قرار گرفتند.
نتایج
نتایج سنجش میزان مقاومت گیاه زیتون در محیط حاوي
200mM نمک: گیاهچه هاي موجود در محیط MS با غلظت 1/2 حاوي 200 میلی مولار نمک رشد کمتري را نسبت به گیاهچه هاي شاهد در محیط MS با غلظت 1/2 (شرایط غیر تنش) نشان دادند . شکل 1a) و .(1b
سنجش میزان پرولین: سنجش پرولین نشان داد که میزان پرولین در گیاهچه زیتون طی تنش افزایش می یابد (شکل
2 و جدول .(1
بر اساس آنالیز آنووا وتست دانکن میانگین میزان پرولین در غلظتهاي نمکی صفر ، 100 و 200 با هم اختلاف معنی دار دارند .
شکل ( a ) - 1 گیاهچه زیتون در محیط کشت MS با غلظت ( b ) 1/2 گیاهچه زیتون در محیط کشت MS با غلظت 1/2حاوي 200 میلی مولار نمک
جدول - 1 میزان پرولین درغلظتهاي نمکی صفر ،100 و 200 میلی مولارنمک در گیاهچه زیتون
200 100 0 NaCl (mM)
3714/46±132/87 2228/41±63/77 250/77±2/03 تست
121
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
شکل -2 میزان پرولین در گیاهچه شاهد و گیاهچه هاي تحت تنش شوري در غلظتهاي 100 و 200 میلی مولار نمک
نتایج حاصل از دات بلاتینگ : با استفاده از تکنیک دات نتایج حاصل از آنالیز وسترن بلاتینگ: براي اطمینان
بلاتینگ مشخص شد که پادتن ایجاد شده قدرت شناسایی بیشتر از نتیجه به دست آمده تکنیک وسترن بلاتینگ انجام
پروتئین مربوط به P5CS را دارد. همان طور که در شکل شد. همان طور که در شکل 4 مشخص است باند مربوط
3 مشخص است در کنار نمونه مربوط به پپتید سنتز شده، به نمونه تحت تنش بسیار پررنگ می باشد در حالی که
عصاره پروتئینی مربوط به گیاهچه هاي زیتون در شرایط باند مربوط به نمونه اي که در شرایط غیر تنش قرار داشته
تنش وعدم تنش نیزمورد آنالیز دات بلاتینگ قرار گرفتند. به صورت نازك و کم رنگ نمایان شده است. تمام این
نتایج نشان می دهد که در گیاه تحت تنش زیتون، حلقه نتایج بازگو کننده این مطلب است که در گیاه زیتون تحت
رسوبی تشکیل شده بسیار پررنگتر از حلقه رسوبی مربوط تنش اسمزي، سطح بیان P5CS بالا می رود.
به گیاه شاهد در شرایط غیر تنش می باشد.
شکل -3 آنالیز دات بلاتینگ شماره :1پپتید P5CS شماره :2
پپتید کنجوگه با BSA (بووین سرم آلدئید ) شماره :3 گیاهچه
زیتون در شرایط غیر تنش شماره :4 گیاهچه زیتون تحت شرایط
شکل -4 آنالیز وسترن بلاتینگ. شماره :1 گیاهچه شاهد شماره :2
تنش
گیاهچه تحت تنش
