بخشی از مقاله
چکیده:
اساسی ترین مرحله در کاربرد موفق شیوههاي گوناگون زیست فنآوري در برنامههاي بهسازي، باززایی درون شیشهاي است و مرحله القاي بهینه کالوس پیش نیاز باززایی غیرمستقیم میباشد. قطعات برگ و دمبرگ حاصل از جوانه هاي کشت بافت سه رقم تجاري گل هاي رز شاخه بریده Orange Juice, Roulette و Vendetta به منظور بررسی کالزایی مورد ارزیابی قرار گرفتند.
القاء کالوس در تمامی ریزنمونه در تیمارهاي 2,4-D و 2,4,5-T در ترکیب با اسید آمینه L-proline یا بدون آن، صورت گرفت. قطعات برگی تیمار شده با 2,4,5-T در دو رقم Orange Juice, Roulette نسبت به ریزنمونه دمبرگ در رقم Vendetta از میزان کالوس تولیدي بیشتري برخوردار بودند. تیمار 2,4-D سبب ریشه زا شدن کالوسها شد در حالیکه در هیچ کدام از غلظتهاي 2,4,5-T کالوس ریشهزا دیده نشد.
تیمار اسید آمینه L-proline از میزان ریشه زایی کالوسها در تیمار 2,4-D کاست. ریزنمونه دمبرگ توانایی کمتري در ریشهزایی نشان داد. اختلاف معنی دار مشاهده شده بین ارقام و بافتها در تولید کالوس، حاکی از نقش موثر ژنوتیپ بر این صفت در گل رز می باشد.
مقدمه:
گل رز با بیش از 2000 سال تاریخچه کشت، یکی از مهمترین گیاهان زینتی از لحاظ اقتصادي و سطح زیر کشت در کل جهان است .[2-1] گل رز در بین 10 گل اول شاخه بریده دنیا، همواره برترین جایگاه را داشته و بیشک ملکه گلها نیز باقی خواهد ماند .
گلهاي رز امروزي نتاج تلاقی هفت تا ده گونه گل رز میباشند. هتروزیگوسیتی و تفرق صفات بالاي نتاج بر اثر دگرگشنی درختچههاي چوبی رز، سبب شده از روشهاي غیر جنسی براي تکثیر آنها استفاده شود .[4] با لحاظ تمامی مشکلات، بهنژادگران تا کنون رقم هاي جدید و امروزي گل رز را به دنیا معرفی نمودهاند، ولی مزایاي استفاده از نشانگرهاي مولکولی، نقشههاي پیوستگی ژنتیکی، تکنیک ژنومیکس و مهندسی ژنتیک میتواند راه گشاي بهبود اصلاح ژنتیکی گل رز باشد.
اغلب اساسی ترین مرحله در اجراي موفق شیوههاي گوناگون زیست فنآوري در برنامههاي بهسازي، باززایی درون شیشهاي است. باززایی از طریق اندام زایی خواه مستقیم یا غیر مستقیم در بسیاري از گونهها از جمله گل رز گزارش شده است . در اندام زایی غیر مستقیم مرحله حد واسط کالزایی بین دو مرحله عدم تمایز و متمایز شدن نهایی دیده میشود
جنینهاي رویشی میتوانند بهطور مستقیم هم از ریزنمونه و یا بطور غیر مستقیم از کالوس حاصل شوند .[9] ریزنمونههاي مختلفی براي تولید کالوس و کالوس جنینزا مورد بررسی قرار گرفته اند. در اغلب تحقیقات، از تیمارهاي اکسینی 2, 4-D, NAA, 2ip , p- - - CPA به تنهایی یا گاه در ترکیب با سایتوکینینهایی همانند کینتین یا بنزیل آدنین بهره گرفته شده است.
استفاده از محیطهايپایه MS، SH و B5 به تنهایی یا در ترکیب با برخی اسیدهاي آمینه همانند پرولین [10] و سیستئین در اغلب این بررسیها به چشم میخورد .
در طی سالهاي گذشته گزارش هاي زیادي مبنی بر القاي کالوس در گل رز منتشر شده است، گرچه استفاده از تنظیم کننده رشد گیاهی 2,4,5-T در گل رز متداول نبوده و به تازگی به دنیاي کشت بافت آن پیوسته است . از دیگر سو، بهسازي گل رز و معرفی ارقام جدید با تکیه بر شیوههاي نوین علم زیست فنآوري حائز اهمیت می باشد. در این تحقیق، در ابتدا به بهینه سازي القاي کالوس پرداخته شده و سپس سعی در بررسی شرایط مطلوب براي القاي جنین زایی رویشی و باززایی درون شیشه اي در این رقم هاي تجاري شاخه بریده گل رز، شده است.
مواد و روش ها
ریزنمونهي مورد استفاده در این بررسی براي القاي کالوس، برگها و دمبرگهاي حاصل از رشد شاخسارههاي سه رقم تجاري گل رز شاخه بریده به نام هاي Orange Juice, Roulette و Vendetta در شرایط درون شیشهاي بود .[12] در سطح زیرین برگها، 4 یا 5 خراش سطحی به طور عمود بر رگبرگ اصلی ایجاد شد. سپس به نحوي که پشت برگ در تماس با محیط باشد، کشت شدند.
دمبرگها به صورت افقی روي محیط کشت داده شدند. محیط کشت پایه MS حاوي 30 گرم بر لیتر ساکارز و 2/5 گرم بر لیتر ژلرایت در تمامی تیمارهاي القاي کالوس در نظر گرفته شد. دو نوع تنظیم کننده رشد گیاهی از گروه اکسینها 2,4-D و 2,4,5-T به ترتیب در غلظتهاي - 13/5 µM - و 5/7 µM - ، - 11/4 در ترکیب با 0/0 یا 600 میلیگرم بر لیتر L-proline به عنوان تیمار تنظیم کننده رشد گیاهی در نظر گرفته شدند. اسیدیته محیط به 5/7 رسانده شد و سپس اتوکلاو شد. کشتها تحت شرایط تاریکی در دماي 23±2 درجه سلسیوس قرار گرفتند. پس از گذشت چهار هفته میزان و چگونگی کالوسهاي تولیدي یادداشت برداري شدند.
نتایج و بحث
کالوسها در مقادیر و نوعهاي مختلف پس از گذشت چهار هفته در تمامی تیمارها مشاهده شدند. نوع رقم بر کالزایی تأثیر مستقیم داشته و رقم Orange Juice از بیشترین میزان تولید کالوس برخوردار بودند
جدول-1 تجزیه واریانس تیمار هاي القاي کالوس بر صفات اندازه گیري شده در ریزنمونههاي ارقام رز در شرایط درون شیشهاي
به نظر میرسد نوع رقم تعیین کننده اصلی روند واکنش به تیمارها بوده است و نتایج اغلب بررسیها بیانگر نقش موثر ژنوتیپ در چگونگی پاسخ رقم به محیط کشت و تیمارهاي به کار رفته در زمینه القاي کالوس و باززایی آن میباشد.
اثر تیمار، بافت و تعامل بین آنها با رقم اختلاف معنی داري نشان داد - جدول - 1 رقم Orange Juice در تمامی تیمارها واکنش یکسان داشت ولی تیمار 2,4,5-T در دو رقم دیگر میزان تولید کالوس را افزایش داد - شکل. - 1 تاثیر مثبت این تنظیم کننده رشد گیاهی بر روند کالزایی در بسیاري از ارقام به اثبات رسیده است، در عین حال به نظر میرسد این تنظیم کننده رشد گیاهی اثر مستقیم ژنوتیپ بر کالزایی را تحت تاثیر قرار داده و کمرنگ تر مینماید.[13]
شکل -1 نمودار مقایسه میانگین اثر متقابل رقم× تیمارهاي القاي کالوس بر درصد تولید کالوس ارقام رز در شرایط درون شیشهاي.
گرچه نوع بافت به تنهایی بر میزان تولید کالوس تاثیر نداشت، ولی واکنش بافتها در رقم هاي مختلف با هم متفاوت بود، در رقم Vendetta ریزنمونه دمبرگ تولید کالوس بیشتري داشت ولی در دو رقم دیگر برگ موفق تر عمل نمود - شکل . - 2 با توجه به واکنش متفاوت بافتها و رقمها و اختلاف ناچیز بین تولید کالوس در برگ و دمبرگ در رقم Vendetta به نظر میرسد بافت برگ ریزنمونه مناسب تري براي کسب کالوس جنین زا در ارقام گل رز باشد. تا کنون اثبات شده است که احتمال تبدیل کالوسهاي حاصله از ریزنمونه برگی به کالوس جنین زا بسیار بالاتر بوده است .
شکل -2 نمودار مقایسه میانگین اثر متقابل رقم× بافت بر درصد تولید کالوس ارقام رز در شرایط درون شیشهاي.
تنظیم کننده رشد گیاهی 2,4-D بیشتر سبب تولید کالوسهاي ریشهزا1 شده و حضور اسید آمینه از میزان ریشه زایی کالوسها کاست، که همین امر احتمال تبدیل موفقیت آمیز آنها در مرحله بعد به کالوس جنینزا را کمرنگ مینماید گرچه به نظر میرسد تنظیم کننده رشد گیاهی2,4,5-T عملکرد بهتري داشته و حتی در غلظتهاي بالاتر نیز سبب ریشهزایی نشد در عین حال، ریزنمونه دمبرگ نسبت به برگ، توانایی کمتري براي ریشه زایی از خود نشان دادنتایج بدست آمده موید برتري این تنظیم کننده رشد گیاهی به منظور القاي کالوس و در ادامه رسیدن به کالوس جنین زا و باززایی از آن میباشد
