بخشی از مقاله
چکیده
بررسی حاضر به منظور آگاهی از روند تکامل ژن سیتوکروم b در گونههای مختلف آنالیز فیلوژنی و روند انتخاب طبیعی در طی تکامل انجام گرفت. توالی ژن سیتوکروم b در گونههای مختلف بر اساس جستجو در بانکهای اطلاعاتی ژنوم NCBI به دست آمده و همتراز شدند. درصد جانشینی و جایگزینی نوکلئوتیدها با استفاده از روش حداکثر درستنمایی و نیز ترسیم درخت فیلوژنتیک و تعیین روند انتخاب طبیعی به روش neighbor-joining به دست آمدند. نتایج حاصل از مطالعات بیوانفورماتیک نشان داد که درصد جانشینی بازهای پیریمیدینی بیشتر از بازهای پورینی بوده است.
مقدار عددی dN\dS کمتر از یک بود که نشان دهنده انتخاب خالص در طی تکامل این ژن ها است. این نوع انتخاب سبب وقوع تغییرات در جایگاههایی میشود که هیچ تغییری در توالی پروتئینی ژنها حاصل نمیکند. اما از طرفی سبب مساعد شدن شرایط برای انتخاب مثبت در مراحل بعدی تکامل میشود. درخت فیلوژنتیک برای ژن مذکور در موجودات مختلف نشان میدهد که به طور کلی پروتئین سیتوکروم b در موجودات مختلف بر اساس مسیر تکاملی خود به دو دسته مجزا تقسیم میشود.
کلمات کلیدی: تجزیه فیلوژنی، سیتوکروم b، تکامل مولکولی
.1 مقدمه
در سالهای اخیر تکنیکهای پیشرفته ملکولی که تفاوت بین افراد را در سطح ملکول DNA مشخص میکند جهت مطالعه تنوع ژنتیکی و روابط فیلوژنتیک بین جمعیتها و نژادهای مختلف به ابزار قابل اعتماد تبدیل گردیدهاند . - 2 - از مزایای DNA میتوکندریایی - mtDNA - میتوان به بیش از هزار نسخه به ازای هر سلول، کوچک بودن اندازه آن نسبت به DNA ژنومی، وراثتپذیری مادری، هاپلوئید بودن، عدم وجود نوترکیبی در آنها، عدم وجود اینترون، امکان تکثیر با استفاده از آغازگرهای اختصاصی و توالییابی نواحی حفاظت شده و نواحی حفاظت نشده که برای مطالعات تکاملی گونهها وابسته میباشد، اشاره نمود . - 7 -
امروزه ژنوم میتوکندری به طور متداول برای مطالعات فیلوژنتیک و تکامل مورد استفاده قرار میگیرد . - 21 - ژنهای میتوکندری ابزار مهمی برای مطالعات مختلفی در زمینههای تکامل جانوران و فیلوژنتیک میباشد . - 4 - ژن سیتوکروم b میتوکندری در بسیاری از مطالعات برای بررسی روابط فیلوژنیک در گونههای مختلف مورد استفاده قرار گرفته است و اطلاعات توالی بسیاری از گونهها در دسترس است 8 - ،. - 9 مشخص شده است که به دلیل تنوع بالای این ژن در مقایسه با سایر ژنها میتوان با بررسی قطعه کوچکی از آن گونههای مختلف پستانداران را شناسایی کرد . - 22 - فاصله ژنتیکی بیانگر میزان تفاوت نوکلیوتیدی موجود در بین دو توالی است.
میزان واگرایی ژنتیکی بین گونههای مختلف به مراتب از واگرایی ژنتیکی درون گونهای بیشتر است . - 18 - بررسی تنوع ژنتیکی درون و بین جمعیتها با استفاده از ژنوم میتوکندری از سال 1979 شروع شد. از آن زمان به بعد مطالعات تئوری و تجربی این مولکول بسیار متغیر به دانش ما درباره جمعیتهای جانوری افزوده است و مقایسه توالیهای مناطق مختلف ژنوم میتوکندری به دلیل سرعت بالای تکامل ژنوم میتوکندری در مقایسه با ژنوم هسته شواهدی را در مورد تنوع ژنتیکی و منشاء تکاملی گونهها فراهم مینماید . - 20 -
توالیهای کد کننده پروتئین در DNA میتوکندریایی در هر گونه محافظت شده بوده، بنابراین برای مطالعه روابط تکاملی نسبت به DNA ژنومی گونههای مختلف مناسب است . - 17 - بررسی توالی نوکلیوتیدی ناحیه سیتوکروم b میتوکندری در بین نژادها یا در درون آنها میتواند شاخص مناسبی از میزان تنوع موجود در جمعیتهای مورد مطالعه باشد . - 1 - در فیلوژنی مولکولی از اطلاعات توالیهای مولکولی برای احیاء کردن روابط تکاملی بین گونههای مختلف و برآورد زمان واگرایی ارگانیسمها استفاده میشود . - 23 - هدف از بررسی حاضر تعیین روابط تکاملی بین ژنهای سیتوکروم b در گونههای مختلف و نحوه انتخاب در طول تکامل آنها است.
.2 مواد و روشها
با استفاده از ابزار BLAST در بانکهای اطلاعاتی ژنوم NCBI توالیهای ژن سیتوکروم b و اطلاعات مربوط به mRNA آنها در گونههای مختلف از جمله گاو، گوسفند، بز و سایر گونهها به دست آمد و شماره دستیابی آنها در قالب جدول 1 ارائه شد. توالیهای ژن سیتوکروم b در گونههای مختلف با استفاده از نرم افزارMEGA6 همتراز شدند . - 10 - برای مقایسه توالیها و اطلاع از فراسنجههای ژنتیکی از قبیل تعداد جهشها، تنوع نوکلئوتیدی، تعداد جایگاههایی که در آنها جایگزینی مشابه اتفاق افتاده و همچنین تنوع آنها از نرم افزار Dnasp v5 استفاده شد . - 19 -
توالی حفاظت شده که نقش های عملکردی در ژن های این خانواده دارند نیز تعیین شدند 15 - ،. - 13 به منظور ترسیم درخت فیلوژنتیک، توالی پروتئینی ژن سیتوکروم b برای گونههای مورد بررسی با استفاده از نرمافزار MEGA6 پیشبینی گردید. پس از ویرایش توالیها و حذف نواحی غیر کد کننده، درخت فیلوژنی با استفاده از روشNJ1 رسم گردید . - 10 - در این روش از ماتریسی - Q - استفاده میشود که در این ماتریس از کل شاخهها استفاده شده و کمترین مقدار که بیان کننده شباهت بالای دو شاخه باشد انتخاب شده و در یک انشعاب از درخت فیلوژنی به کار میرود. مقادیر Bootstrap بوسیله 100 بار نمونهگیری مجدد بدست آمد. ترسیم درخت فیلوژنی بوسیله روش NJ با استفاده از رابطه 1 انجام گردید.
در رابطه بالا؛ :d - i, j - فاصله بین شاخه i و j، :k شاخه kام درخت، :r تعداد کل شاخهها و :Q - i, j - مقدار عددی شاخههای i و j است . - 11 - از روش حداکثر درستنمایی ترکیبی2برای بدست آوردن میزان جانشینی و جایگزینی نوکلئوتیدها در بازهای پورینی و پیریمیدینی و همچنین ترسیم ماتریس فاصله ژنتیکی بین و درون گونهها استفاده گردید . - 11 - بررسی تغییرات نوکلئوتیدی که باعث تغییر اسیدهای آمینه شدهاند - dN - نسبت به تغییرات نوکلئوتیدی که تأثیری در اسید آمینه حاصله نداشتهاند - dS - ، یک روش مفید و بسیار کارآمد جهت تشخیص روند انتخاب طبیعی در طول تکامل برای ژنها میباشد.
بنابراین، با استفاده از مقدار عددی این نسبت - dN\dS - روند انتخاب طبیعی برای ژن سیتوکروم b شناسایی گردید. مقادیر dN و dS به ترتیب با استفاده از روابط 2 و 3 قابل محاسبه هستند.در این روابط، dN، نسبت جایگاههای دارای جایگزینی نامشابه و dS نیز نسبت جایگاههای دارای جایگزینی مشابه میباشند. معنیدار بودن مقدار عددی dN\dS با آزمون فیشر در سطح احتمال 5 درصد بررسی شد . - 14 -
.3 نتایج و بحث
تعداد کل جهشهایی که در طی تکامل این ژنها رخ داده است برابر 1044 جهش بوده و توزیع آنها در طول ژنوم متفاوت میباشد. تعداد جایگاههای چندشکل نیز 649 جایگاه بوده است، که روند انتخاب خالص در این ژنها را توجیه میکند .تعداد جایگاههای Indel در این خانواده ژنی 3 مورد بود که به میزان کمتری سبب تغیییر ساختارهای پروتئینی در مقایسه با طول بیشتر شده است. جایگاههای Indel دارای عملکرد مهمی در هر ژن بوده و به صورت همبسته و گروهی عمل میکنند. از سویی این جایگاهها به بررسی و مطالعه این گونه پروتئینهای ناپایدار در محیطهای in vitro کمک میکنند . - 6 - درخت فیلوژنتیک روابط تکاملی توالیهای پروتئینی این ژنها را نشان میدهد. مقادیر بالای Bootstrap در محل انشعاب شاخههای درخت نشان میدهد، که درخت فیلوژنی ازدرجه اعتماد بالایی برخوردار است.
پروتئینهای ژن سیتوکروم b در گونههای مورد بررسی بر پایه مسیر تکاملی به دو دسته تقسیم میشوند.همانطورکه ذکر شد، نتایج حاصل از تغییرات نوکلئوتیدی که باعث تغییر اسیدهای آمینه شده اند - dN - ، نسبت به تغییرات نوکلئوتیدی که تأثیری در اسید آمینه به دست آمده نداشتهاند - dS - یک روش مفید و بسیار کارآمد برای تشخیص روند انتخاب طبیعی در طول تکامل برای ژنها میباشد . - 14 - اگر این نسبت بیشتر از یک باشد، انتخاب مثبت،اگر کمتر از یک باشد انتخاب خالص و اگر برابر یک باشد انتخاب خنثی را در طی تکامل این ژنها نشان میدهد . - 24 - مقدار عددی این نسبت - dN\dS - که برابر 0/3604 است - جدول . - 2 روند انتخاب خالص در طی تکامل برای این ژنها را نشان میدهد این نوع انتخاب سبب تثبیت عملکرد این ژنها در طی روند تکامل و پیشرفت در جهت خالصسازی عملکرد آنها میشود.
انتخاب خالص سبب وقوع تغییرات در جایگاههایی میشود که هیچ تغییری در توالی پروتئینی ژنها حاصل نمیکند. اما از طرفی سبب مساعد شدن شرایط برای انتخاب مثبت در مراحل بعدی تکامل میشود. پایین بودن نرخ جانشینی به جایگزینی نوکلئوتیدی و وجود بخشهای پروتئینی حفاظت شده از دلایل وقوع این نوع انتخاب در تکامل این خانواده ژنی میباشد. در صورت حذف نواحی پروتئینی حفاظت شده دقت برآورد افزایش مییابد 5 - ،. - 16
جدول 3 نتایج حاصل از درصد جابه جایی نوکلئوتیدهای ژن سیتوکروم b را نشان میدهد. بیشترین نرخ جانشینی مربوط به میزان جانشینی بازهای پیریمیدین یعنی تبدیل تیمین به سیتوزین به مقدار 20/84 درصد و سیتوزین به تیمین به میزان 18/12 درصد میباشد. متوسط نرخ جانشینی بازهای پورین 11/12 درصد میباشد. از طرفی متوسط میزان جایگزینی بازهای پیریمیدین به پورین 4/31 درصد و پورین به پیریمیدین 5/76 درصد میباشد. تبدیل نوکلئوتید سیتوزین به تیمین در نواحی مختلف ژنی به خصوص نواحی CPG که نوکلئوتید سیتوزین در معرض متیله شدن بوده ومتعاقباً باعث تبدیل نوکلئوتید گوانین به آدنین در زنجیره مقابل شده میتواند علت این تغییرات باشد 12 - ،. - 3
