بخشی از مقاله
چکیده:
مقدمه وهدف: اشرشیا کلی دارای چهار گروه فیلوژنی است. گروههای A و B1 سوشهای روده ای و عامل اسهال شدید، اما گروههای B2 و D سوشهای خارج روده ای و عامل بیماری هایی مثل عفونت ادراری، سندرم اورمی همولیتیک و مننژیت نوزادی و سپتی سمی می باشند. اگرچه گوشت شایع ترین عامل انتقال اشرشیا کلی ایجاد کننده اسهال است، اما سبزیجات و آبمیوه ها نیز در ایجاد این بیماری نقش دارند. بنابراین هدف از این تحقیق جدا سازی و تعیین گروههای فیلوژنی باکتری اشرشیا کلی از سبزیجات سالادی رستورانها درشهرستان جهرم در سال 1392می باشد. مواد و روش ها: برای این منظور 450 نمونه ها از انواع سبزیجات سالادی در مرحله سرو از ظروف آشپزخانه رستورانها از شهرستان جهرم جمع آوری و با استفاده از تست های میکروبیولوژیکی باکتریهای اشرشیا کلی جدا سازی شدند. سپس به روش PCR و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی، گروههای فیلوژنی yjaA+ - B2 و - chuA ، yjaA- - D و - chuA-، TspE4. C2+ - B1 و - chuA- و TspE4.C2- - A و - chuA- شناسایی خواهند شد.
یافته ها: از 450 نمونه مورد بررسی 100 نمونه اشرشیاکلی جدا سازی شد و درصد فراوانی گروههای فیلوژنی بترتیب گروه %18 A، گروه %3 B1، گروه % 69 B2 و گروه %10 D بود. نتیجه گیری: با توجه به اینکه گروههای A و B1 سوش های روده ای و B2 و D خارج روده ای می باشند در این تحقیق مشخص شد که ایزوله های اشرشیاکلی جدا شده از سبزیجات سالادی بیشتر متعلق به گروه فیلوژنتیکی B2 یعنی از سوش خارج روده ای می باشد و این موضوع بر ضرورت بیشتر رعایت موازین بهداشت مواد غذایی تاکید دارد.
کلمات کلیدی: اشرشیا کلی، سبزیجات سالادی، گروههای فیلوژنی
مقدمه
سویه های مختلف اشرشیاکلی عامل انواع مختلف بیماری ها شامل اسهال،اسهال خونی، سندروم اورمی همولایتیک، عفونت های مثانه و کلیه، پنومونی و مننژیت می باشد. سویه های مختلف آن معمولا با بیماری های گو ناگونی ارتباط دارند یعنی سویه ای از اشرشیاکلی که موجب بروز اسهال می شود قادر نیست که عفونت ادراری یا مننژیت را ایجاد کند و بر عکس. تنوع سویه های مختلف اشرشیاکلی به این دلیل است که سویه های مختلف، ژن های بیماریزای متفاوتی را کسب کرده اند. برخی از این ژن ها مشابه ژن هایی هستند که در سایر ارگانیسم های بیماریزا یافت می شوند و ممکن است از طریق انتقال ژن کسب شده باشند اما برخی از ژن های موجود در اشریشیاکلی تنها در این باکتری یافت شده است - ابیگل - .
فیلوژنی مولکولی به معنای استفاده از ساختار مولکولها برای دستیابی به ارتباطات تکاملی جانداران است. زیست شناسان مجبورند فیلوژنی را با استنباط روابط تکاملی میان جانداران امروزی بازسازی کنند. در گذشته روابط فیلوژنی از روی ویژگی های فنوتیپی که اغلب شاخصه های آناتومیک می باشند بازسازی می شدند اما امروزه داده های مولکولی شامل پروتئین ها و رشته های DNA برای ساخت درخت های فیلوژنیک استفاده می شوند . - Edvard et al., 1964 ; Speer, Vrian 1998; Cavalli Sforza, Edvard AWF 1967 -
گروههای فیلوژنی اشرشیا کلی شامل گروههای D-B2-B1-A می باشند. گروههای A و B1 شامل سوشهای شایع روده ای هستند که بیشتر در کشور های در حال توسعه در بالغین و بچه ها باعث بیماریهایی مثل اسهال شدید می شوند و شامل پاتوتایپ های DAEC -EIEC - EPEC -ETEC و EHEL می باشند 14 - و . - 19 اما گروههای B2 و D اغلب سوشهای خارج روده ای شامل EHEC - - Uropathogenic E.coli - UPEC - Entroheamoragic - و - Meningitidis E.coli - MNEC می باشند که به ترتیب بیماری هایی مثل عفونت ادراری، سندرم اورمی همولیتیک ومننژیت نوزادی وسپتی سمی را ایجاد می کنند و سوش خطرناک E.coli که همان O157.H7 می باشد که باعث سندرم اورمی همولتیک می گردد جزء گروه فیلوژنی D می باشد . - Renato et al., 2008; Peter et al., 1990 - گروههای فیلوژنی B2 دارای ژنهای - yjaA+ و - ChuA+ ، گروه فیلوژنی D دارای ژنهای - yjaA- و - ChuA+، گروه فیلوژنی B1 دارای ژنهای - - ChuA- , TSPE4.C2+ و گروه فیلوژنی A شامل ژنهای - , ChuA- - TSPE4.C2 - می باشد . - Renato et al., 2008 -
معمولا غذا از طریق دست کارگران خطوط تهیه و تولید مواد غذایی، در صورت رعایت نکردن بهداشت فردی و از طریق مدفوع حیوانات در دامداری ها و کشتارگاه ها به اشرشیا کلی آلوده می شود. بنابراین آلودگی مواد غذایی با اشرشیا کلی از طریق دست آلوده، خاک، آب، مدفوع و حشرات امکان پذیر بوده و در کل انتقال این باکتری، مدفوعی-دهانی است. . در ابتدا عفونت با اشرشیاکلی O157: H7 در نتیجه مصرف فرآورده های گوشت گاو خصوصا همبرگر نیم پز ایجاد شده بود ولی اخیرا موارد عفونت در رابطه با میوه، سبزی و آب آلوده نیز گزارش شده است - مهدی زاده . - 1389 با توجه به اهمیت مسمومیت های غذایی که با خوردن سبزیجات آلوده ایجاد می شوند این تحقیق ، به منظور تعیین گروههای فیلوژنتیکی باکتری اشریشیا کلی جدا شده از سبزیجات سالادی برای اولین بار در شهرستان جهرم انجام شد.
مواد و روش ها
در اوایل سال 1392، تعداد 450 نمونه از انواع سبزیجات سالادی رستورانها در مرحله سرو از ظروف آشپزخانه رستورانها جمع آوری و پس از ارسال به آزمایشگاه معاونت غذا و داروی دانشگاه علوم پزشکی جهرم، 100 ایزوله اشرشیاکلی با انجام تست های میکروبیولوژیکی جداسازی شد. برای این منظور ابتدا 45 میلی لیتر محلول رینگر بر روی 5 گرم از نمونه ریخته شد. از نمونه آماده شده 10 میلی لیتر بر روی محیط کشت لوریل سولفات براث دوبل برده شد. پس از گرمخانه گذاری در صورت وجود کدورت یا گاز در لوله دورهام، 1 سی سی از لوله های مثبت به محیط کشت EC Broth منتقل گردید. در صورت وجود گاز در لوله دورهام از لوله هایEC Broth مثبت به محیط پپتون واتر ساب کالچر شد. پس از 24 ساعت گرمخانه گذاری و مثبت شدن با معرف کواکس، تست های تاییدی روی آنها انجام گردید. و در صورت مثبت بودن، آزمایشات تاییدی - TSI, Urease,، Motility, - Citrate , LD روی نمونه ها انجام شد. گروههای فیلوژنی yjaA+ - B2 و - chuA و yjaA- - D و - chuA- و . TspE4 . C 2 + - B1 و - chuA- و TspE4.C2- - A و - chuA- با استفاده از روش PCR و ژنها و پرایمرهای اختصاصی شناسایی شدند. پس از استخراج DNA از نمونه های اشریشیا کلی با استفاده از کیت شرکت فرمنتاز، واکنش PCR با کمک PreMix PCR شرکت بیونیر و پرایمرهای اختصاصی جدول-1 انجام شد و نتایج حاصل از آزمایشات با استفاده از نرم افزار SPSS مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.
نتایج و بحث
از 450 نمونه مورد بررسی 100 نمونه اشرشیاکلی جدا سازی شد. نتایج حاصل از آزمایش PCR بر روی این 100 نمونه نشان داد که درصد فراوانی گروههای فیلوژنی بترتیب گروه %18 A، گروه %3 B1، گروه % 69 B2 و گروه %10 D بود. در تحقیقی که توسط Renato و همکاران در سال 2007، در کشور برزیل بر روی منابع مختلف آب آشامیدنی شامل سیستم های توزیع و آب های معدنی و چاه ها انجام شد 15 سوش در گروه فیلوژنی A، 19 سوش در گروه فیلوژنی B1، 2 سوش در گروه B2 و 13 سوش در گروه D بودند. نتایج بدست آمده بر اساس تکنیک PCR بر روی سوش های پاتوژنیک بدست آمده از آب به این صورت بود: در 30درصد آب های آشامیدنی، گروه های B2 و D جدا شدند که اغلب شامل گونه های پاتوژنیک خارج روده ای بودند . - Renato et al., 2008 - در سال Ghanbarpour 2000 و همکاران در ایران، گروه های فیلوژنیکی باکتری اشرشیا کلی جدا شده از ماکیان را با روش PCR مورد بررسی قرار دادند که B1 7/18 درصد و گروه A 56/51 درصد بود . - Ghanbarpour 2000 - در سال Ho 2009 و همکاران 174 ایزوله اشرشیاکلی های جدا شده از انسان و حیوانات تولید کننده غذا مورد بررسی قرار دادند..
گروه فیلوژنتیکی B2, B1, A,D به ترتیب %7/6 ، %80/8، %11/5، %54/1 مشاهده شد. ایزوله های مدفوعی انسان و حیوان متعلق به گروه های Aو B1 بودند. اغلب نمونه های ادراری متعلق به گروه های B2 و D بودند . - Ho et al., 2009 - نتایج بیشتر مطالعات نشان می دهد که گروه فیلوژنی ایزوله های باکتری اشرشیاکلی جدا شده از نمونه های مواد غذایی در هر منطقه جغرافیایی متفاوت است و با توجه به اینکه هر گروه فیلوژنی قادر به ایجاد بیماریهای خاصی هستند، لذا تعیین آن در هر منطقه حائز اهمیت است.
نتیجه گیری کلی
با توجه به اینکه گروههای A و B1 سوش های روده ای و B2 و D خارج روده ای می باشند در این تحقیق مشخص شد که ایزوله های اشرشیاکلی جدا شده از سبزیجات سالادی بیشتر متعلق به گروه فیلوژنتیکی B2 یعنی از سوش خارج روده ای می باشد و این موضوع بر ضرورت بیشتر رعایت موازین بهداشت مواد غذایی تاکید دارد.
سپاسگزاری:
با تشکر و قدردانی از معاون غذا و دارو و آزمایشگاه تحقیقاتی دانشگاه علوم پزشکی جهرم که در انجام این تحقیق به ما را یاری رساندند.
