بخشی از مقاله
چکیده
گوسفند به عنوان حیوانی اهلی براي قرن ها نقش مهمی در تامین منابع غذایی مردمان سرزمین فلات ایران بر عهده داشته است و این منطقه به عنوان منشا این گونه به شمار می رود. توالی یابی ژنوم میتوکندري یکی از بهترین و رایج ترین روش ها براي طبقه بندي ژنتیکی جمعیت ها و گونه هاي نزدیک به هم می باشد. هدف از این تحقیق تعیین توالی ناحیه HVR1از ژنوم میتوکندري نژاد هاي گوسفند بومی شال و سنگسري ایران بود.
براي انجام این تحقیق 20 نمونه خون از هر دو جنس از گوسفندان غیر خویشاوند جمع آوري شد. پس از استخراج DNA از آنها، ناحیه مورد نظر توسط پرایمرهاي اختصاصی با تکنیک PCR تکثیر شده و تعیین توالی شد. سپس با مقایسه توالی ناحیه HVR1 بدست آمده از ژنوم گوسفند شال و سنگسري با توالی ناحیه مشابه از ژنوم گوسفندان سایر نژاد ها از گروه هاي مختلف، مشخص شد که این نژاد ها متعلق به گروه هاپلوتیپی A می باشند، همچنین مشابهت ژنتیکی آن ها با دو نژاتد دیگر ایرانی - بلوچی و مغانی - ممکن است به دلیل نزدیکی جغرافیایی مکان زیستی آنها باشد.
مقدمه
نگهداري و پرورش گوسفند در ایران به منظور تأمین پوست، گوشت، شیر و الیاف پشمی از سابقه اي طولانی بر خوردار است اما در حال حاضر ایران نسبت به سایر کشورهاي جهان با توجه به وسعت، تعداد گوسفند کمتري دارد و به دلیل تلاقی تلاقیهاي کنترل نشده باعث از بین رفتن خلوص ژنتیکی شده است. این مسئله ضرورت استفاده از علم ژنتیک براي شناسایی دامهاي پر تولید بیش از پیش احساس می شود.
امروزه استفاده از ژنوم میتوکندري یکی از کاربردي ترین روش ها در بررسی هاي تنوع زیستی و ارزیابی بین گونه ها و نژادها محسوب می شود
منطقه D-Loop منطقه آغاز همانند سازي در ژنوم میتوکندري است و داراي دو ناحیه بسیار متغیر 1HVR1 و 2HVR2 است. این دو منطقه، هیچ پروتئینی را کد نمی کنند و در شروع رونویسی نقشی ندارند و جهش هاي ایجاد شده در آنها بدون تغییر به نسل هاي بعد منتقل می شود
شناسایی توالی این مناطق به عنوان مشخصه ژنتیکی ثابت محسوب می شود و می تواند به تهیه شناسنامه ژنتیکی و نگهداري خلوص نژادهاي بومی کمک زابدي نماید. در ضمن با مقایسه توالی یک گونه یا نژاد با گونه ها و نژاد هاي دیگر که توالی آن ها در بانک ژن موجود است امکان مطالعات فیلوژنیکی، بررسی اشتقاق گونه ها و محاسبه فاصله نسلی وجود دارد.
از طرفی توالی یابی این مناطق شاخص مناسبی را از میزان تنوع موجود در جمعیت ارائه می دهد و امکان تشخیص گونه ها و نژاد ها را نیز فراهم می کند و می تواند نقش مهمی در جهت حفظ گونه هاي بومی از خطر
انقراض و اختلاط ژنتیکی با سایر نژاد ها کمک داشته باشد
تا کنون چهار گروه هاپلوتیپی A، B، C و D در گونه گوسفند تشخیص داده شده است. لذا هدف از این تحقیق تعیین توالی بخشHVR1 ناحیه D- Loop ژنوم میتوکندري وزن به طول تقریبی 420 جفت باز در دو نژاد گوشتی بومی ایران، نژاد سنگسري با خصوصیات خوب پرواري و شال یکی از بهترین نژادهاي سنگین و تعیین رابطه فیلوژنی این نژادها با سایر نژادها بود.
مواد و روش ها
براي اجراي این تحقیق نمونه خون از 20 رأس قوچ و میش نژاد شال از ایستگاه تحقیقاتی مرکز تحقیقات قزوین و 20 رأس گوسفند نژاد سنگسري از ایستگاه پرورش و اصلاح نژاد دامغان تهیه شد. استخراج DNA با استفاده از روش بیلز و همکاران - 2007 - انجام شد. براي آگاهی از میزان DNA و میزان خلوصو کیفیت آن از الکتروفورز ژل آگارز 0/8 درصد و براي تعیین کمیت آن از دستگاه اسپکتروفتومتر استفاده شد.
جهت تکثیر اختصاصی ناحیه HVR1 از یک جفت پرایمر اختصاصی - 5’-AGTATTGAGGACGGGGTAA-3’ - و - 5’-TAACTGTGGGGGTAACTATTT-3’ - که توسط نقاش و همکاران - 2006 - مورد استفاده قرار گرفته بود، استفاده شد. براي انجام واکنش زنجیره اي پلیمراز از کیت Genepak Universal استفاده شد. نمونه ها پس از تکثیر بر روي ژل آگارز 1/5 درصداجرا شدند و سپس استخراج و خالص سازي قطعات مورد نظر از ژل با استفاده از کیت استخراج از ژل انجام گرفت. سپس نمونه ها جهت تعیین توالی به شرکت ماکروژن آلمان فرستاده شدند.
تجزیه و تحلیل توالی ها
جهت تجزیه و تحلیل توالی هاي بدست آمده از برنامه هاي نرم افزاري BioEdit، CLUSTAL W، MEGA 4 استفاده شد و توالی ها با یکدیگر و با سایر توالی هاي موجود در بانک جهانی ژن مقایسه شدند. به منظور انجام مقایسات فیلوژنی از توالی ناحیه HVR1 ژنوم میتوکندري چندین نژاد مختلف گوسفند موجود در پایگاه اطلاعاتی بانک ژن استفاده شد. در نهایت درخت فیلوژنی با استفاده از روش - NJ - Neighbor- joining رسم گردید.
نتایج و بحث
در این تحقیق 420 جفت باز از ناحیه HVR1 ژنوم میتوکندري گوسفندان نژاد شال و سنگسري تعیین توالی شد. براي تعیین هاپلوتیپ ها از روش آنالیز ایندکس عدم توافق با استفاده از نرم افزار MEGA4 استفاده شد. در این روش تشخیص هاپلوتیپ بر اساس فاصله ترکیبات نوکلئوتیدي توالی ها انجام شد و تعداد 9 هاپلوتیپ در گوسفند نژاد شال و 7 هاپلوتیپ در گوسفند نژاد سنگسري بدست آمد. این تعداد هاپلوتیپ در مقایسه با تعداد کل نمونه ها می تواند نشان دهنده تنوع بالا در نمونه ها باشد.
به عنوان مثال نقاش و همکاران - 2006 - با استفاده از تکثیر و توالی یابی بخش HVR1 از D-loop ژنوم میتوکندري به طول 480 جفت باز از گونه Ovis orientalis موجود در ترکمنستان، قزاقستان، تاجیکستان و پاکستان از تعداد 221 نمونه فقط 20 هاپلوتیپ تشخیص دادند.
تنوع نوکلئوتیدي براي نژاد شال حدود 0 /0092 و در نژاد سنگسري 0/0083 تعیین شد که بسیار نزدیک به این مقدار در گروه هاپلوتیپی A بود. به طور کلی تنوع نوکلئوتیدي در گروه هاپلوتیپی A حدود 0/01 و در گروه هاپلوتیپی B حدود نیز 0/01 و در گروه هاپلوتیپی C حدود 0/004 گزارش شده است
تاکنون در گوسفندان اهلی - Ovis orientalis - چهارگروه هاپلوتیپی A، B، C و D تشخیص داده شده است. تعیین گروه هاپلوتیپی یکی از مهمترین مراحل در آنالیز این قبیل داده ها می باشد. با تعیین گروه هاپلوتیپی می توان موقعیت این نژاد در بین نژادهاي دیگر را تعیین نمود و در نهایت برخی تغییرات در خصوصیات مورفولوژیکی نژاد ها را توجیه نمود. به منظور رسم نمودار فیلوژنی، 4 توالی مرجع DQ097431=A, DQ097451=B, DQ097457=C,
DQ242212=D به عنوان تعیین کننده 4 گروه هاپلوتیپی اصلی استفاده شدند و توالی Consensus بدست آمده براي گوسفند سنگسري و شال با این توالی هاي مرجع و 26 توالی ثبت شده دیگر در NCBI مقایسه شدند
نتایج آنالیز فیلوژنی اولاًمشخص کرد که گوسفندان شال و مغانی به همراه دو نژاد دیگر ایرانی - مغانی و بلوچی - که توالی آنها از NCBI استخراج شده بود، در گروه هاپلوتیپیA قرار دارندو ثانیاًدر آنالیز فیلوژنی گوسفندان ایرانی با یکدیگر نزدیکی بیشتري دارد که این امر می تواند نشان دهنده منشا مشترك این نژاد ها با توجه به منطقه جغرافیایی محل زندگی نزدیک آنها باشد
شکل شماره :1 نمودار درختی NJ رابطه فیلوژنیک توالی Consensus گوسفند نژاد شال و سنگسري و سایر نژادهاي اخذ شده از بانک جهانی ژن از جمله مغانی و بلوچی از ایران، علامت * توالی هاي شاخص، * مربوط به گروه A، ** گروه B، *** گروه C و **** گروه D
