بخشی از مقاله
چکیده
از آنجایی که ارزش اقتصادی کلاله زعفران بسیار بالاست و مهمترین جزء عملکرد آن به حساب میآید، درک تکوین گلهای زعفران و ژنهای مؤثر در تشکیل آن میتواند راههای افزایش عملکرد را آشکار نماید. بنابراین هدف از بررسی حاضر مطالعه فیلوژنتیک و تکاملی ژنهای MADS-box مؤثر در تشکیل گل در زعفران بود. برای همه کلاسهای مختلف ژنی MADS-box در زعفران جستجو صورت گرفت و با استفاده از ابزار BLAST در بانک اطلاعاتی ژنوم - NCBI - توالی نوکلئوتیدی ژنهای MADS-box در آرابیدوپسیس، گل میمونی، برنج به عنوان مدل گیاهان تک لپه و مارچوبه بدست امدند.
محاسبه درصد جایگزینی نوکلئوتیدها با استفاده از روش حداکثر درستنمایی و تکامل مولکولی و ترسیم درخت فیلوژنتیک به وسیله روش neighbor- joining صورت گرفت. به طور کلی 21 توالی برای زعفران پیدا شد که مربوط به کلاسهای مختلف بوده و به طور کلی 68 توالی حاصل شد. نتایج مطالعات بیوانفورماتیک نشان داد که ژنهای خانواده MADS-box دارای نسخههای متعددی بوده که بیان ژنهای خاص مسئول صفات مختلف را کنترل میکنند.
درصد جایگزینی بازهای پیریمیدینی از میزان جایگزینی بازهای پورینی بیشتر میباشد. از طرفی نسبت dS/dN برای ژنهای خانواده MADS-box در زعفران، گل میمونی، مارچوبه و برنج به ترتیب برابر 1/191 ، 1/039، 1/134 و 1/005 به دست امدند.
این مقادیر حاکی از وجود انتخاب مثبت در طی تکامل این ژنها میباشد. انتخاب مثبت علاوه بر تثبیت عملکرد واریتههای قبلی سبب پیشرفت در جهت به وجود آمدن واریتههای جدید میشود. بنابراین واریتههای جدید میتوانند سبب بوجود آمدن پروتئینهای عملکردی و گسترش دامنه فعالیت ژنهای این خانواده شود. نتایج حاصل از ترسیم درخت فیلوژنتیک نیز نشان داد که پروتئینهای خانواده نظر به مسیر تکاملیشان به دو گروه مجزا تقسیم میشوند که ژنهای مربوط به زعفران در دسته اول قرار گرفتهاند.
-1 مقدمه
زعفرانٌ - Crocus sativus L. - یکی از اعضای خانواده زنبق - Iridaceae - است. از نظر گیاهشناسی زعفران گیاهی بسیار پیچیده است. ردهبندی آنها وابسته به صفات مشخصی چون دارا بودن فروبرگها، پیش برگها، برگه و برگکها میباشد. در حقیقت مانند بسیاری از تک لپهایهای پتالوئیدی، گیاهینسبتاً ساده است - ابراهیم زاده و همکاران، . - 1385 زعفران گیاهی دائمی، علفی و زینتی است که میتواند یک دوره خشک را به شکل بنه در زیر خاک و به صورت رکود و یا خواب بگذراند. بنههای آن مدور، سخت، گوشتدار و موازی و قهوهای رنگ است، این گیاه اغلب دارای 1 تا3 گل میباشد و ساقه آن بسیار کوتاه و در زیر سطح خاک قرار دارد گل نر- ماده، جام گل لولهای باریک و بلند و به رنگ گلپوش است
شناسایی ژرم پلاسمٍ زعفران و گونههای وحشی آن و بررسی روابط ژنتیکی و تکاملی بین آنها میتواند در حفظ ذخایر ژنتیکی و شناسایی گونههای وحشی وابسته جهت افزایش مواد مؤثره مورد استفاده قرار گیرد. خصوصیات ظاهری، از جمله طول و ضخامت کلاله َ، به دلیل نقش آن در خصوصیات ادویهای، حائز اهمیت زیادی میباشد و در ارزیابی تنوع و طبقهبندی آن مورد استفاده قرار می-گیرد
گلهای زعفران دوجنسی هستند حلقه اول شامل سه کاسبرگ، حلقه دوم شامل سه گلبرگ و حلقه های بعدی به ترتیب شامل سه پرچم و یک مادگی با کلاله سه شاخه است
در برخی گونههای زراعی زعفران کلاله چند شاخه نیز گزارش شده است . - Beiki et al., 2011 - در طی سالهای گذشته ایران با داشتن حدود 74 هزار هکتار سطح زیرکشت و تولید بیش از 250 تن زعفران در سال بزرگترین تولیدکننده و صادرکننده زعفران در جهان بوده است و بیش از 85 تا 90 درصد تولید جهانی این محصول گرانبها به ایران اختصاص دارد. در سال 1392 بالغ بر 8 تن زعفران به ارزش 200 میلیون دلار از کشور صادر شده است.
نتایج پژوهشهای مختلف نشان داده است که زعفران خواص دارویی قابل توجهی از جمله نشاط آوری، آرام بخشی، کاهش چربی و فشار خون برای انسان دارد . - Wang et al., 2011 - خواص عمده این گیاه در کلاله آن و به دلیل وجود سه متابولیت مهم موجود در آن شامل کروسینٌ، پیکروکروسینٍ و سافرانالَ میباشد. این سه متابولیت به ترتیب مسئول رنگ، مزه و بوی زعفران میباشند.
از آنجایی که ارزش اقتصادی کلاله زعفران بسیار بالاست و مهمترین جزء عملکرد آن به حساب میآید، درک تکوین گلهای زعفران و ژنهای مؤثر در تشکیل آن میتواند راههای افزایش عملکرد را آشکار نماید . - Tsaftaris et al., 2005 - مطالعات مختلف نشان دادهاند که ژنهای مختلفی در فرآیند تکوینی گلدهی دخالت دارند که از جمله این ژنها میتوان به ژنهای MADS-box اشاره کرد - Chang . - et al., 2010 البته علاوه بر گیاهان، ژنهای MADS-box در مخمر و جانوران نیز وجود دارند و نقش مهمی در کنترل فرآیندهای مهم به ویژه تمایز ایفاء میکنند
این ژنها علاوه بر تعیین نوع اندام گل و تکامل آن در گیاه، در فعالیتهای تنظیمی مثل تعیین نوع مریستم، توسعه جانبی ریشه و کنترل زمان گلدهی نیز دخالت دارند . - Tsaftaris et al., 2004 - در واقع الگوی بیان ژنهای MADS-box در برگ و قسمتهای مختلف گل متفاوت بوده و از این طریق میتوان ژنهایی که در تشکیل قسمتهای مختلف گل نقش دارند را تعیین نمود
مجموعه ای از فاکتورهای رونویسی را رمز میکنند که به فرآیندهای تشکیل گل کمک میکنند . - Tsaftaris et al., 2006 - این موارد در گذشته نیز تایید شده بودند به گونهای که برخی محققین بر اساس مطالعات مورفولوژیکی و ژنتیکی جهشهای هومئوتیک گل در دو گیاه آرابیدوپسیسُ یا رشادی و آنتوریومِ یا درفش گیاه، مدلی برای تکامل و تمایز اندامهای گل پیشنهاد کردند. این مدل بعدها به عنوان مدل ABC شناخته شد و به دلیل سادگی و قابل اجرا بودن به طور گسترده برای بسیاری از گونههای نهاندانگان مورد توجه قرار گرفت . - Thomas, 2001 - در بررسیهای گوناگون نشان دادند که تقریباً تمام ژنهای مرتبط با سیستم ABC به مجموعه MADS-box تعلق دارد
الگوی بیان ژنهای MADS-Box زعفران در برگها، گلها و چهار ارگان مختلف گل شامل کاسبرگهای داخلی و خارجی، پرچم و برچه به وسیله روش RT-PCR6 مطالعه شده است
این مهم برای ایزولههای کلاس B، C و E در زعفران و با استفاده از cDNA ساخته شده از برگها، گلها و سایر اندامهای گل مطالعه شده است. ژنهای MADS-box در گیاهان می-توانند به 12 شاخه عمده تقسیمبندی شوند که هر کدام شامل 1 تا 6 پارالوگ از آرابیدوپسیس و ارتولوگهای مشهوری از سایر گیاهان هستند
ژنهای کلاسهای مختلف A ، B، C، D و E که مرتبط با توسعه گل میباشند در داخل شاخههای فیلوژنی جداگانهای قرار میگیرند. در کلاس A ژنهای AP1 یا SQUA قرار میگیرند. کلاس B شامل ژنهای AP3، PI یا DEF و GLOBOSA میباشد. کلاسهای C و D ژنهای AG را در بر دارند همچنین کلاس E نیز شامل ژنهای AGL6 و SEP است که کنترل زیادی روی سیستم ABC دارند
البته همهی ژنهای ذکر شده در فرآیند تعیین هویت اندامهای گل دخالت ندارند.
Tsaftaris و همکاران - 2007 - با جمع آوری تعداد cDNA 20 از ژنهای کلاسهای مختلف MADS-box نشان دادند که به طور کلی این ژنها در 5 شاخه اصلی قرار میگیرند. آنها ذکر کردند که ژنهای AP1/FUL، SEP و AGL6 در یک گره مشترک به همگرایی میرسند که این شاخه از درخت فیلوژنی همیشه بازسازی شده است و با شاخه AG اتصال دارد. شاخههای AP3 و PI نیز از یک گره مشترک سهم میبرند.
آنالیز فیلوژنی ژنهای MADS-box در زعفران نشان داده که تمام واریتههای آن از یک نیای مشترک منشأ گرفتهاند. به عنوان مثال ژنهای CsatAP1/FUL، CsatpaleoAP3، CsatAG و CsatSEP3 از نظر اشتقاق ژنتیکی بسیار به هم شباهت دارند. در مقایسه با برخی تک لپهایها مثل ذرت و برنج، زعفران تنها حاوی ژن اجدادی SEP3 است و توالیهای دیگر آن بسیار شبیه هستند اما در ذرت و برنج، علاوه بر SEP3، 2 SEP و 4 نیز خالصسازی شدهاند
با بررسی مجموع مقالات منتشر شده بین المللی، هیچ مطالعهای حداقل در سالهای اخیر - ژنوم موجودات در حال بروز رسانی هستند - برای مشخص کردن پراکندگی ژنومی و بررسی فیلوژنی اعضای خانواده ژنهای MADS-boxدر زعفران خصوصاً در ایران انجام نشده است. بنابراین هدف از بررسی حاضر مطالعه مولکولی و تکاملی ژنهای MADS-box مؤثر در تشکیل گل در زعفران میباشد.
-2 مواد و روشها
-2-1 شناسایی ژنهای MADS-box
برای پیدا کردن توالیهای نوکلئوتیدی این ژنها از پایگاه اطلاعاتی بانک ژنٌ یا پایگاه اطلاعاتی توالی ژنتیک مؤسسه ملی بهداشتٍ مربوط به سایت NCBI3 و برای همه کلاسهای مختلف ژنی MADS-box در زعفران جستجو صورت گرفت و توالیهای نوکلئوتیدی مورد نظر را دانلود و در نرم افزار GENETYX وارد شد.
همه اطلاعات مربوط به این توالیها اعم از طول ژن، منابعی که آنها را برای بارگذاری در بانک ژن فراهم نمودهاند، شماره شناسایی در بانک ژن و ... ثبت شدند. سایر موجوداتی که برای مقایسه و تعیین مسیر تکاملی توالی نوکلئوتیدی ژنهای MADS-box با زعفران مد نظر قرار گرفتند شامل آرابیدوپسیس - Arabidopsis - و گل میمونی - Antirrhinum - به عنوان گیاهانی دولپهای و برنج به عنوان مدل گیاهان تک لپه - Oryza sativa japonica - و مارچوبه - Asparagus officinalis - انتخاب شدند. بنابراین با وارد نمودن شماره شناسایی ژنهای کلاسهای مختلف MADS-box زعفران در ابزار BLAST، توالیهای نوکلئوتیدی برای گیاهانی مذکور به دست آمدند.
-2-2 تعیین مسیر تکاملی
نتایج حاصل از تغییرات نوکلئوتیدی که منجر به تغییر توالیهای پروتئینی شود، یک روش ساده برای بررسی وجود نوع انتخاب طبیعی در مسیر تکاملی خانوادههای ژنی در جوامع مختلف میباشد. اگر این نسبت بیشتر از یک باشد انتخاب مثبت، اگر کمتر از یک باشد انتخاب منفی و اگر برابر یک باشد انتخاب خنثی را در روند تکاملی نشان میدهد . - Li and Huang, 2007 - مقادیر dN و dS با استفاده از روابط زیر قابل محاسبه هستند:
در این روابط نسبت جایگاههای با جایگزینی نامشابه و شامل نسبت جایگاههای با جایگزینی مشابه میباشند. واریانس مقادیر dN و dS نیز با استفاده از معادلات زیرمحاسبه میشود:
در معادلات بالا؛ N شامل تعداد جایگاههای دارای جایگزینی نامشابه و S برابر تعداد جایگاههای دارای جایگزینی مشابه در یک توالی میباشند. مقادیر Ps و PN نیز بر اساس روابط زیر محاسبه میشوند
