بخشی از مقاله
چکیده
مطالعه حاضر برای طبقهبندی فیلوژنی ژن کاندیدای تحمل به تنش شوری، HvCBL4، در 62 اکوتیپ جو انجام گرفته است. توالی نوکلئوتیدی این ژن به هفت کانتیگ تقسیم گردید. برای هر کانتیگ یک درخت فیلوژنی تهیه گردید. طبقه بندی ژنوتیپها بر اساس میزان همولوژی ژن در کانتیگهای مختلف بوده است. اثرات تجمعی همه موتاسیونهای نوکلئوتیدی بر فیلوژنی یک ژنوتیپ ارزیابی گردید.
نتایج نشان داد، ژنوتیپهایی که در گروههای مشابه قرار گرفتند همولوژی و قرابت ژنتیکی باالیی نسبت به یکدیگر داشتند. در برخی موارد، ژنوتیپهای متعلق به مناطق مختلف - جغرافیایی - در یک گروه مشترک قرار گرفتند. این بدین معنی است که گروهبندی آنها مستقیماً تحت تأثیر منشأ ژنتیکی آنها میباشد. ما همچنین دریافتیم که مناطق اگزونی و اینترونی نرخ موتاسیون و میزان همولوژی در کانتیگها را تحت تأثیر قرار دادند. زیرا در کانتیگهای مختلف یک ژنوتیپ مقادیر متعددی از همولوژی وجود داشت. ما میتوانیم تأثیر موتاسیونها روی ساختار و عملکرد ژن را نیز بررسی نمائیم.
نوع و محل وقوع موتاسیون عامل مهمی در این زمینه است. همه موتاسیونهایی که در ژنوتیپها رخ دادند در جهت سازگاری آنها با محیطی بوده که در آن رشد یافته بودند. تغییرات ژنتیکی مشابه و سطح باالی همولوژی در ژنوتیپهای رشد یافته در مناطق مختلف متأثر از شوری، که در مواجه با شرایط مشابه اقلیمی قرار گرفتند، این امر را توجیه می کند.
مقدمه
شوری خاک یکی از مهمترین مشکالت محیطی است که تولید محصول زراعی را تحت تاثیر قرار میدهد . - 1 - افزایش شوری خاک یا آب موجب ایجاد اختالل در فرآیندهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه شده و باعث بروز مشکالتی مانند عدم تعادل یونی، کمبود مواد معدنی، تنش اسمزی، سمَیَت یونی و تنش اکسیداتیو میگردد . - 2 - این شرایط با اجزای سلولی همانند DNA، لیپیدها و رنگدانه ها اثر متقابل داشته و رشد و نموَ اکثر گیاهان زراعی را کاهش میدهد. تحمل نسبت به تنش شوری صفتی چند ژنی است که شامل الف - تقسیم بندی مقادیر زیاد نمک در داخل گیاه ب - تنظیم اسمزی و ج - تغییرات مورفولوژیکی میباشد
مطالعاتی که در زمینه تحمل به تنش شوری انجام گرفته است شامل موارد زیر است: -1 برنامه های اصالح کالسیک که علی رغم برخی موفقیتها، به دلیل ماهیت چند ژنی بودن این صفت محدود گردیده است، و -6 موتاسیونهایی که منجر به از بین رفتن و حذف عملکرد ژن میگردند برای شناسائی و مطالعه ژنهای مسئول تنش مورد استفاده قرار گرفتهاند. توسعه گیاهان دارای پتانسیل ژنتیکی بالقوه برای تحمل نسبت به این تنش، به کاهش استفاده از آب نیز کمک میکند
در تحقیقات گزارش شده است که جمعیت هایی که در مناطق تحت تنش شوری رشد مییابند دارای تنوع ژنتیکی گستردهتری هستند . - 11 - گیاه جو1 یکی از متحملترین گیاهان زراعی است که طی سالها، از روشهای مختلف فیزیولوژیکی برای تعیین تنوع فنوتیپی تحمل به شوری در این گیاه استفاده شده است . - 11 - از نظر میزان محصول دانه در محیط شور، جو یکی از اعضای متحمل به شوری در تیره تریتیاسه است ومکانیسم تحمل به شوری در این تیره عموماً شامل تجمع یون سدیم در طول دوره رشد گیاه میباشد
از نقطه نظر تجمع این یون در تیره تریتیاسه، گیاه جو دارای تنوع ژنتیکی باالیی است. شوری یکی از موانع اصلی افزایش تولید محصول در جو بوده و تحمل به این تنش در مراحل مختلف رشد گیاه متفاوت است. حساسترین مراحل رشد گیاه در مقابل تنش شوری در جو دو مرحله جوانه زنی و گیاهچگی میباشد و با افزایش سن گیاه میزان تحمل آن نیز افزایش مییابد. تأثیر این تنش در مرحله جوانه زنی جو بیشتر مربوط به اثرات یونی است - 12 - ، در حالیکه در مرحله گیاهچگی تنش شوری حاصل اثرات اسمزی میباشد
ژن HvCBL4 نقش مهمی در تحمل گیاه جو نسبت به تنش شوری دارد. مشخصترین مسیر سیگنالدهی که مختص تنش شوری است شامل افزایش یون کلسیم در سیتوسول میباشد . - 16 - در این مسیر، افزایش القائی یون سدیم در سیتوسول احتماالً از طریق یک پروتئین calcineurin B-like به نام CBL4که اصوالً تحت عنوان SOS3 شناخته شده است، تشخیص داده میشود. کمپلکس CBL4/CIPK24 - SOS3/SOS2 - از طریق زنجیره اسید چرب مریستول با CBL4/SOS3 پیوند کوواالنسی تشکیل میدهد که موجب فسفریالسیون و در نتیجه فعال شدن آنتی ریپورتر Na+/H+ موجود در بخش مرزی غشاء یعنی SOS1 میگردد
مواد و روشها
در این تحقیق از 62 ژنوتیپ جو که منشأ جغرافیایی آنها مناطق مختلف شور در دنیا میباشد، به عنوان مواد گیاهی استفاده گردید. هدف از این تحقیق، طبقه بندی فیلوژنی ژنوتیپهای مورد مطالعه بر اساس تنوع نوکلئوتیدی موجود در ژن مقاوم به به شوری HvCBL4 بوده است. نمونه DNAی ژنومی هر ژنوتیپ طبق روش سقائی و همکاران - 1614 - با اندکی تغییرات استخراج گردید. طراحی پرایمرها با استفاده از اطالعات توالی mRNAی ژن HvCBL4 که در پایگاه اطالعاتی Gene Bank موجود است، انجام گرفت. طراحی پرایمرها با استفاده از از نرم افزار آنالین Primer3 - http://frodo.wi.mit.edu/primer3/ - انجام گرفت.
چهار پرایمر برای این ژن طراحی گردید. تکثیر قطعات ژنومی مورد نظر با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز صورت گرفت. توالی یابی قطعات تکثیری پرایمرها برای 62 ژنوتیپ مورد مطالعه با استفاده از دستگاه ABI 3100 انجام گرفته است. آنالیز دادهها با استفاده از نرم افزار CodoneCode Aligner انجام گرفته است. از این نرمافزار برای ترکیب توالیها و یافتن انواع موتاسیونهای تک نوکلئوتیدی و تهیه نقشههای فیلوژنی استفاده گردید.
نتایج و بحث
توالی نوکلئوتیدی چهار قطعه تکثیر شده از ژن HvCBL4 در هر یک از 62 ژنوتیپ مورد مطالعه به کمک نرم افزار با یکدیگر ترکیب شده و توالی نهایی6 با توالی نوکلئوتیدی مربوط در رقم شاهد - رقم کلیپر جو - مقایسه گردید و به هفت کانتیگ تقسیم بندی شد. به دلیل وجود تعداد زیاد و نرخ باالی موتاسیون، درخت فیلوژنی برای هر کانتیگ به صورت مجزا ترسیم گردید. مبنای تشکیل درخت فیلوژنی در این مطالعه، مقایسه میزان همولوژی قطعات ژنی تکثیری در ژنوتیپهای مورد آزمایش بوده است.
همولوژی بر اساس تأثیر همه انواع پلیمورفیسمهای نوکلئوتیدی از جمله حذف و اضافه و تکرار نوکلئوتیدی و نیز انواع موتاسیونهای همگن و غیر همگن و به کمک نرم افزار CodonCode Aligner ارزیابی گردید. هرچه مقدار همولوژی مناطق ژنی بین ژنوتیپها بیشتر بوده، آنها در گروههای نزدیک به هم یا در یک زیرگروه طبقهبندی شدهاند و با کاهش میزان همولوژی، فاصله ژنتیکی بین ژنوتیپها افزایش یافته و آنها در گروههای مستقلی گروهبندی شده-اند.
درخت فیلوژنی ژن HvCBL4 در کانتیگ اول شامل 11 شاخه اصلی و تعدا زیادی شاخه فرعی بوده است - شکل . - 1 شاخه اصلی سوم بزرگترین شاخه در این طبقه بندی و شامل 63 ژنوتیپ بوده است که اختالف همولوژینسبتاً زیادی با شاخه های اصلی اول و دوم نشان داده اند . - 141/42 - دو ژنوتیپ موجود در شاخه اصلی اول متعلق به کشورهای ایران و لیبی می باشند که میزان همولوژی در آنها نسبتاً باال بوده است. بین ژنوتیپهای ایرانی در گروههای مختلفتنوع ژنتیکی نسبتاً خوبی از نظر این ژن وجود داشت.
با توجه به اینکه ژنوتیپ شاهد - رقم کلیپر جو که یک رقم مقاوم به شوری است - در این درخت فیلوژنی قرار گرفته است میتوان استنباط نمود که سطوحی از مقاومت به شوری در همه ژنوتیپهای این درخت فیلوژنی وجود دارد. بر مبنای میزان تفاوت همولوژی بین شاخه های اصلی، می توان ژنوتیپهای شاخه اصلی اول و دوم را در گروه اول، ژنوتیپهای موجود در شاخه های اصلی سوم تا هشتم را - به دلیل عدم وجود تفاوت همولوژی - صفر - و یا اختالف اندک در میزان همولوژی - - 13/21 - در گروه دوم، و شاخه های اصلی نهم و دهم را در گروه های مستقل سوم - تفاوت همولوژی برابر با 116/44 با شاخه اصلی ماقبل خود - و چهارم - تفاوت همولوژی برابر با 163/14 با شاخه اصلی ماقبل خود - گروهبندی نمود.
شکل -1 درخت فیلوژنی ژن HvCBL4 در کانتیگ اول
شکل -2 درخت فیلوژنی ژن HvCBL4 در کانتیگ دوم
درخت فیلوژنی این ژن در کانتیگ دوم شامل 1 شاخه اصلی و 5 شاخه فرعی بوده و اختالف ژنتیکی بین شاخههای اصلی بسیار کم بوده است - شکل
ژنوتیپ شماره 2 متعلق به کشور لیبی بوده و مقاوم به شوری است. بنابراین، میتوان نتیجه-گیری نمود ژنوتیپهای ایرانی که با این ژنوتیپ در یک شاخه فرعی قرار گرفتهاند دارای حداقل فاصله ژنتیکی با آن بوده و با احتمال زیاد از نظر فنوتیپی نیز مقاوم به شوری هستند. فاصله ژنتیکی بین شاخه اصلی که این ژنوتیپ متعلق به آن است با سایر شاخههای اصلی بسیار اندک بوده و احتمال وجود فنوتیپ مقاوم به شوری در ژنوتیپهای آن گروهها نیز میتواند افزایش یابد. ژنوتیپ شماره 11 که اولین ژنوتیپ در این درخت فیلوژنی است هیبریدی از دو رقم کلیپر و گیزا 161 میباشد و کلیپر یک رقم جوی مقاوم به شوری است. لذا میتوان گفت کلیه ژنوتیپهایی که در شاخه اصلی اول طبقه بندی شده اند.
