بخشی از مقاله
چکیده
گوسفند به لحاظ اقتصادی یکی از حیوانات اهلی مهم در ایران و همچنین در سایر نقاط جهان است. نژادهای بومی گوسفند که به عنوان سرمایه ملی به شمار می روند، حفاظت از آن ها از نظر تنوع زیستی بسیار حائز اهمیت است. استفاده از نشانگرهای ژنتیکی توالی یابی ژنوم میتوکندری یکی از کاربردی ترین روش ها برای تشخیص گونه ها و تعیین رابطه فیلوژنی بین جمعیت ها و گونه ها است. هدف از انجام این تحقیق تنوع ژنتیکی و فیلوژنیکی ناحیه سیتوکروم b ژنوم میتوکندری گوسفندان اهلی نژاد لری، لری بختیاری و عربی، به منظور ارتباط فیلوژنیک بین نژادهای مذکور و همچنین مقایسه با هاپلوتایپ های شاخص شناسایی شده گوسفند اهلی می باشد. برای این منظور تعداد 30 نمونه خون از نژاد های گوسفند لری، لری بختیاری و عربی - از هر نژاد 10 نمونه - با آگاهی از عدم رابطه خویشاوندی جمع آوری شد و پس از استخراج DNA، ناحیه مورد نظر توسط پرایمرهای اختصاصی به روش PCR تکثیر و سپس توالی یابی شدند. با تجزیه وتحلیل داده های حاصل از تعیین توالی و مقایسه توالی ناحیه سیتوکروم b گوسفندان ایرانی با یکدیگر و با توالی مشابه از ژنوم گوسفندان سایر نژادها مشخص شد که گوسفندان عربی و لری در گروه گوسفندان با هاپلوتیپ B قرار گرفتند و نژاد بختیاری در شاخه ی جدا گانه و در گروه گوسفندان با هاپلوتیپ A قرار گرفت. که این امر در مورد نژاد لری و عربی ممکن است به دلیل نزدیکی جغرافیایی مکان زیستی آنها باشد. واژگان کلیدی: ژنوم میتوکندری، فیلوژنی، گوسفند، ناحیه سیتوکروم b
مقدمه
اهلی کردن گوسفند حدود 11000 -10000سال پیش در منطقه گسترده ای از کوه های زاگرس شمالی ایران تا جنوب شرقی آناتولی ترکیه رخ داده است. آسیای صغیر و منطقه خاورمیانه ارتباط جغرافیایی مهمی بین قاره آسیا و اروپا ایجاد می کند. به این دلیل گونه های این مناطق سطح بالایی از جریان ژن، اختلاط و تمایز در طول زمان اهلی شدن را منعکس می کنند . - 7 - گوسفند به لحاظ اقتصادی یکی از حیوانات اهلی مهم در ایران و همچنین در سایر نقاط جهان است - . - 3 سهم گوسفند در ایران را می توان به عنوان منبع گوشت، پشم، پوست و شیر در نظر گرفت. خصوصیات ژنتیکی نژادهای مختلف گوسفند، اولین گام برای جمع آوری اطلاعات پایه ای برای بهبود راندمان تولید در این صنعت است. میتوکندری اندامکی است که در سیتوپلاسم همه سلول های یوکاریوتی وجود دارد که قادر به تولید انرژی برای سلول است. در گونه های جانوری ژنوم میتوکندریایی 37 ژن راکد می کند که شامل13 ژن کد کننده زنجیره تنفسی، 22 ژن کد کننده tRNA و 2 ژن کد کنندهrRNA می باشد.
کد کردنtRNA و rRNA نشان دهنده سنتز پروتئین در میتوکندری است - . - 15 جایگاه ژنوم میتوکندری در ماده زمینه ای آن - ماتریکس - و بعضی مواقع چسبیده به غشای داخلی آن است. DNA میتوکندریایی نشانگر بسیار مناسبی برای تشخیص بین گونه ای گروه هایی است که برای 100تا 10000هزار سال از هم جدا بوده اند. همچنین وسعت بالای تکامل DNA میتوکندریایی در مقایسه با DNA هسته ای، باعث شده که از آن برای مطالعات تکاملی استفاده گردد. سرعت جای گزینی نوکلئوتیدها در برخی از نواحی ژنیDNA میتوکندریاییمهره داران عالی َتقریبا 5تا 10 برابر بیشتر از ژنوم هسته ای است - DNA . - 10 میتوکندریایی پتانسیل خوبی برای مطالعه ژنتیک جمعیت و تکامل نشان داده است. میتوکندری تنها اندامک درون سلولی دارای DNA است، نرخ جهش بالا و سیر تکاملی آن 5 تا 10 برابر سریعتر از DNA سلولی است - 17، 12، 5 و. - 2 از مزایای DNA میتوکندی می توران به بیش از هزار نسخه به ازای هر سلول، کوچک بودن اندازه ی آن نسبت به DNA ژنومی، وراثت پذیری مادری، هاپلوئید بودن، عدم وجود نوترکیبی در آن، امکان تکثیر با استفاده از آغازگرهای اختصاصی و توالی یابی نواحی حفاظت شده و حفاظت نشده
که برای مطالعات تکاملی گونه ها وابسته می باشد، اشاره نمود - . - 1 سیتوکروم b یکی از مهم ترین ژن های کد کننده DNA میتوکندری می باشد که به دلیل داشتن توارث مادری، کمترین نرخ نوترکیبی در آن رخ می دهد و به همین دلیل در مطالعات فیلوژنیکی در گونه های مختلف بسیار مورد استفاده قرار می گیرد - DNA . - 6 میتوکندری به خاطر اینکه فقط از طریق مادر منتقل می شود، برای تحقیق پنجره ای را به سمت تاریخ می گشاید. توالیDNA میتوکندری فقط در نتیجه ی جهش های تصادفی، اشتباهات در کپی برداری تغییر می کند. اگر این جهش ها به میزان نسبتا ثابتی وجود داشته باشند، با مقایسه ی بین DNA دو جمعیت می توان وجود وجه مشترک میان آنها و همچنین فاصله نسلی را بررسی کرد. هدف از انجام پژوهش حاضر بررسی تنوع ژنتیکی جمعیت های گوسفندان خوزستان است. از گوسفندان بومی خوزستان می توان گوسفند لری، لری بختیاری و عربی را نام برد.
مواد و روشها
برای انجام این پژوهش تعداد 30 نمونه خون از نژاد گوسفندان لری، لری بختیاری و عربی استان خوزستان، با اطمینان از عدم رابطه خویشاوندی از نقاط مختلف جمع آوری شد. برای استخراج DNA از کیت شرکت سیناکلون استفاده شد. پس از استخراج، به منظوربررسی کیفیت وکمیت DNA های استخراج شده، از روش الکتروفورز ژل آگارز 1درصد و طیف سنجی با دستگاه نانودراپ مدل انجام شد. جهت تکثیر بخشی از ناحیه سیتوکروم b میتوکندری به طول 1140bp از دو آغازگر رفت و برگشت استفاده شد. واکنش زنجیره ای پلی مراز به حجم نهایی 25 میکرولیتر و در 35 چرخه انجام شد. به منظور تایید تکثیر ناحیه مورد نظر طی واکنش زنجیره ای پلی مراز، الکتروفورز محصولات بر روی ژل آگارز 2 درصد انجام گرفت. سپس محصولات واکنش زنجیره ای پلی مراز بعد از تخلیص، جهت توالی یابی به شرکت توپازژن کاوش ارسال شدند. جهت تجزیه و تحلیل توالی های بدست آمده از نرم افزارهای بیوانفورماتیکی مختلفی شامل Bio Edit، MEGA5، استفاده شد. تمام توالی های ناحیه سیتوکروم b ژنوم میتوکندری مربوط به گوسفندان مورد مطالعه توسط نرم افزار Bio Edit، ویرایش شدند. در ادامه با استفاده از ابزار BLAST درصد تشابه توالی ناحیه مورد مطالعه گوسفندان ایرانی با توالی های ثبت شده در پایگاه NCBI تعیین شد. درخت فیلوژنی با استفاده از نرم افزار MEGA5، و به روش Neighbor-joining با 1000بار نمونه گیری مجدد انجام و درخت فیلوژنیکی ترسیم گردید.
نتایج و بحث
استخراج DNA ازخون تمامی نمونه ها با موفقیت انجام شد. الکتروفورز محصولات بر روی ژل آگارز 2 درصد نشان دهنده ی تکثیر بخشی از ناحیه سیتوکروم b به طول 1140bp می باشد - شکل . - 1 الکتروفورز محصولات تکثیر شده بر روی ژل آگارز 2 درصد نشان داد که آغازگرهای طراحی شده به خوبی فعالیت نموده و قطعه اختصاصی را برای تمامی نمونه ها به خوبی تکثیر نموده اند. تعیین توالی قطعات مورد مطالعه برای تمامی نمونه ها انجام گرفت. در ادامه جهت تجزیه و تحلیل توالی های بدست آمده از نرم افزارهای بیوانفورماتیکی مختلفی شامل Bio Edit، MEGA5 استفاده شد. تمام توالی های ناحیه سیتوکروم b ژنوم میتوکندری مربوط به گوسفندان مورد مطالعه توسط نرم افزار Bio Edit، ویرایش شدند. در ادامه با استفاده از ابزار BLAST درصد تشابه توالی ناحیه مورد مطالعه گوسفندان ایرانی با توالی های ثبت شده در پایگاه NCBI تعیین شد. تعیین توالی توافقی یکی از روش های معمول جهت ثبت و شناسایی نژادها می باشد. بنابراین طی این فرآیند 13 توالی ناحیه سیتوکروم b ژنوم میتوکندریایی گوسفندان موجود دربانک جهانی ژن که با نواحی مورد نظرهم پوشانی داشتند از این پایگاه دریافت و تحت رویه Align برنامه MEGA5 هم ردیف سازی شدند و درخت فیلوژنی ترسیم گردید - شکل . - 2 نژاد گوسفند دارای پنج گروه هاپلوتیپ می باشد. در اولین مطالعات بر روی ژنوم میتوکندری گوسفند که توسط پژوهشگران انجام
