بخشی از مقاله
چکیده
در مقایسه با تکنولوژيهاي سنتی مورد استفاده براي ردیابی کپیشمار تراژن نظیر سادرن بلات، استفاده از آنالیزreal-time PCR روشی سریع، ارزان و فراهمآورنده دادههاي زیاد است و میتواند جایگزین مناسبی براي روشهاي قدیمی باشد. در این تحقیق کپیشمار دو قسمت یک تراژن هیبرید سیگما فاکتور sigA - HSig و - sig32 در توتون تراریخته با استفاده از real-time PCR تعیین گردید. تعیین کپیشمار تراژن با استفاده از روش مبتنی بر ژن مرجع داخلی انجام گردید.
در مورد نواحی sig32 و HSigi از HSig دو قسمتی که انتظار میرفت فقط در لاینهاي تراریخته حضور داشته باشند، حضور یک کپی در گیاه تراریخت مشاهده گردید. علاوه بر آن، گیاه تراریخته براي محاسبه کپیشمار قسمت sigA از HSig نیز مورد بررسی قرار گرفت. انتظار بر این بود که این ناحیه داراي چندین کپی داخلی در توتون نوع وحشی باشد. نتایج حاصل از پرایمرهاي sigA هم حضور یک کپی بیشتر در گیاه تراریخته را نسبت به شاهد نشان داد.بدین ترتیب با استفاده از تکنیک real-time PCR کپیشمار تراژنی که نیمی از آن منشأ داخلی داشت، تخمین زده شد.
مقدمه
پس از تولید گیاهان تراریخته یکی از آنالیز هاي ژنتیکی، بررسی و تعیین تعداد ژن وارد شده به ژنوم گیاه میباشد. تعیین تعداد نسخه ژن وارد شده در گیاهان تراریخته معمولاً توسط روشهاي قدیمی انجام میشود که بسیار مشکل و وقت گیر هستند و نیز به DNA با کیفیت و کمیت بسیار بالانیاز دارند و از آنجایی که براي وضوح بالا نیاز است تا از رادیوایزوپوپها استفاده شود، جزء تکنیکهاي پرخطر محسوب میشوند. گاهی اوقات نیز این تکنیکها به درستی و دقت نمی توانند تعداد نسخه هاي ژن وارد شده به ژنوم گیاه را تعیین کنند. به علاوه برآوردها غالبا به طور صحیح منعکس کننده حضور نسخههاي باز آرائی شده تراژن نیستند.
در مقایسه با تکنولوژيهاي سنتی مورد استفاده براي ردیابی کپیشمار تراژن نظیر سادرن بلات، استفاده از آنالیز real-time PCR روشی سریع و ارزان است و میتواند جایگزین مناسبی براي روشهاي قدیمی باشد.
هدف از این تحقیق تخمین کپیشمار دو قسمت یک تراژن هیبرید سیگما فاکتور sigA - HSig و - sig32 در توتون تراریخته با استفاده از real-time PCR بود.
مواد و روشها
DNAي ژنومی به میزان 100 نانوگرم در میکرولیتر رقیق شد و سه سريرقّت1:2 براي دو گیاه تراریخته و شاهد - کنترل-غیرتراریخته - تهیه گردید. آزمایشات real-time PCR با دو تکرار براي هر سريرقّت و با استفاده از دستگاه MyiQ™2 Real- - BIO-RAD - Time PCR Detection System و ترکیب - BIO-RAD - iQ™ SYBR® Green Supermix انجام شد. آزمایشات بر اساس روش یانگ و همکاران - 2007 - و با برنامه زیر انجام گرفت:
مرحله آغاز به مدت 2 دقیقه در 50 درجه سانتیگراد انجام و به دنبال آن 10 دقیقه در 95 درجه قرار داده شد و سپس 45 سیکل با برنامه 25 ثانیه در 95 درجه و 80 ثانیه در 60 درجه انجام شد. آنالیز آزمایشات بر اساس دادههاي حاصل از دستگاه در مرحله تکثیر تصاعدي صورت گرفت. پس از آنالیز، عدد Ct و DeltaRn از آنالیزهاي آماري برنامه SAS و روش یانگ و همکاران - 2007 - براي تخمین کپیشمار بر اساس استخراج شدند.
در این روش تخمین کپیشمار ژن توسط مقایسه با یک ژن داخلی انجام گرفت و لذا واکنشهاي real-time PCR براي ژن مرجع داخلی - NtWBC - و تراژن - HSig - با استفاده از پرایمرهاي اختصاصی طراحی شده براي real-time PCR، انجام شد. بدین منظور براي HSigدو جفت پرایمر طراحی گردید به طوري که طول قطعه تکثیري در تمام موارد از 200 جفت باز کمتر باشد.
نتایج و بحث
تعیین کپیشمار تراژن با استفاده از روش مبتنی بر ژن مرجع داخلی1 به روش یانگ و همکاران - 2007 - انجام شد. در این روش ژن NtWBC به عنوان یک ژن مرجع داخلی استفاده گردید که داراي یک کپی در توتون هموزیگوت - دو کپی آللی - بود و کپیشمار تراژن با این ژن مرجع داخلی موردمقایسه قرار گرفت و بدین ترتیب کپیشمار تراژن تخمین زده شد.
از واکنش real time-PCRدو سري داده استخراج شد و توسط برنامه SAS که توسط یانگ و همکاران - 2007 - ارائه شده بود مورد آنالیز قرار گرفت. بدین ترتیب کپیشمار دو قسمت sigA - HSig و - sig32 در توتون تراریخته تعیین گردید. نتایج در جدول 1 خلاصه شده است. در توتون تراریخته در مورد نواحی sig32 و HSigi از HSig دو قسمتی که انتظار داشتیم فقط در لاینهاي تراریخته حضور داشته باشند، هبستگی خطی ΔCt - لگاریتم 2ي نسبت بین تراژن و ژن مرجع داخلی - برابر با -0/04 به دست آمد که به معناي 0/97 برابر ژن مرجع میباشد. بر این اساس نتایج نشاندهنده حضور یک کپی از تراژن در گیاه تراریخت بود. نتایج در مورد تخمین کپیشمار گیاه توتون کنترل - نوع وحشی - براي sig32 و HSigi به میزان 0/0029 به دست آمد که همانطور که انتظار می رفت نزدیک صفر است
علاوه بر نتایجی که ذکر گردید، گیاه تراریخته براي محاسبه کپیشمار قسمت sigA از HSig نیز مورد بررسی قرار گرفت. انتظار بر این بود که این ناحیه داراي چندین کپی داخلی در توتون نوع وحشی باشد. نتایج در جدول 1 ارائه گریده است. دراین مورد همبستگی خطی ΔCt برابر با 2/7 به دست آمد که به معناي 6/49 - تقرباًی - 6/5 برابر ژن داخلی است و این محاسبه براي گیاه شاهد نیز انجام شد وعدد 5/5 - یک کپی کمتر از گیاه تراریخته - حاصل گردید
زمانی که از پرایمرهاي sig32-rt و HSigi براي محاسبه کپیشمار استفاده گردید که انتظار داشتیم قسمت تکثیر شونده توسط این جفت پرایمر تنها در گیاه تراریخته وجود داشته باشد، محاسبات حضور یک کپی را در گیاه تراریخته تخمین زد. این به معناي برابر بودن کپی شمار با ژن مرجع داخلی NtWBC بود. نتایج حاصل از پرایمرهاي sigA هم که حضور یک کپی بیشتر در گیاه تراریخته را نسبت به شاهد 6/5 - در تراریخته و 5/5 در شاهد - نشان میداد، تأیید دیگري بر صحت نتایج محاسبه کپیشمار بود. حضور 5/5 کپی از سیگما فاکتور در ژنوم گیاه شاهد غیرتراریخته، طبیعی به نظر میرسید به این دلیل که سیگما فاکتورهاي گیاهی توسط خانوادة کوچکی از ژنهاي sig هستهاي کد میشوند .به این دلیل که تخمین کپیشمار بر اساس مقایسه با ژن مرجع بوده و در اینجا ژن مرجع داراي یک کپی در گیاه هموزیگوس - دو کپی آللی - میباشد، بنابراین 5/5 به معناي 11 کپی آللی است که به خاطر امکان اتصال پرایمرهاي sigA-rt به ژنهاي مختلف سیگما فاکتور حاصل شده است.
جدول .1 تعیین کپیشمار ژن در گیاه تراریخته و شاهد.
کپیشمار دو قسمت از ژن HSig براي گیاهان تراریخته و شاهد با استفاده از real-time PCR و با روش مبنی بر ژن مرجع داخلی یانگ و همکاران - 2007 - مورد آنالیز قرار گرفت. ستون 2ناحیه اتصال پرایمرها را نشان میدهد. ستون 3 لگاریتم 2ي نسبت تبدیل شده تراژن به ژن مرجع را نشان میدهد. دادههاي این ستون مستقماًی از برنامه SAS حاصل شدهاند. ستون 4 تخمین عددي کپیشمار را نشان میدهد. سطوح اطمینان براي لگاریتم 2ي نسبتهاي تبدیلشده،دامنه اطمینان را براي کپی شمار ژن حاصل نمود که در ستون 5 نشان داده شده است. کپی شمار محاسبه شده در ستون 6 قرار دارد.
