بخشی از مقاله
مقدمه
اسینتو باکتر بومانی13 پاتوژن مهم بیماری های عفونی بیمارستانی می باشد. و به اغلب به آنتی بیوتیک ها مقاوم بوده این ارگانیسم به طور معمول بیماران بستری شده در بیمارستان که بسیار آسیب پذیر هستند و آنهایی که در پوست شان آسیبی ایجاد شده و یا در مسیر تنفسی شان اختالل دارند، را مورد هدف قرار میدهد . - 1 - جهت کنترل گسترش اسینتو باکتر در بیمارستانها، مشخص کردن مخزن ارگانیسمها و طریقه انتقال آنها الزامی میباشد. جهت طراحی استراتژی های موثر در کنترل عفونت ناشی از این باکتری از تکنیک های فنوتیپی و ژنوتیپی استفاده می شود. از تکنیک های فنوتیپی می توان به بررسی خصوصیات بیوشیمایی، فاژتایپینگ، باکتریوسین تایپینگ، ایمنو بالتینگ، آنالیز پروتئینی و تعیین الگوهای مقاومت ضد میکروبی اشاره نمود. این تکنیک ها در تفکیک و تمایز سویه های قدرت مناسبی ندارند و نمی توانند منبع و چگونگی انتشار و راه های موثردر کنترل انتشار عفونت و ایزوله های شایع را ردیابی نمایند. که برای مطالعه بیشتر در مورد این تکنیکها باید به مطالعهای که توسط برزین -برگوگنه14 و تاور18 انجام شد مراجعه کرد . - 2 -
این مطالعه بسیاری از سیستمهای مولکولی تایپینگ نظیر تعیین خصوصیات پالسمید، ریبوتایپینگ، 11PFGE، آنالیز روش های انگشت نگاری ژنومیک با دقت باالPCR , AFLP12 ژن اینتگراز و اخیرا 15MLST را نیز شامل میشود . - 3 - از تکنیک های دیگر، DNA چند شکلی تکثیر یافته تصادفی - RAPD-PCR - را می توان اشاره نمود. توالی های تکراری بین ژنی که عناصر متقارن خوانده می شوند. اغلب در بخش های غیر کد شونده DNA دیده می شوند. با توجه به تعداد و طول متغییر این توالی های تکراری بین ژنی در هر سویه با طراحی پرایمر مناسب و انجام PCR، تعداد باندهایی که برای هر ایزوله بدست می آید متغیر بوده و بنابراین بر اساس تنوع باندها سویه ها گروه بندی می شوند.
مواد و روش کار
در این بررسی ابتدا تعداد 31 ایزوله اسینتو باکتر بومانی که از عفونت های خونی درچند بیمارستان شهر تهران جدا شده، انتخاب گردید. ابتدا ایزوله ها در آزمایشگاه های میکروب شناسی بیمارستان ها و مراکز درمانی مربوطه جداسازی و تعیین هویت شدند. سپس آزمایش های تشخیصی بیوشیمیایی بر روی آنها انجام پذیرفت. ایزوله ها ابتدا در آزمایشگاه روی محیطهای مک کانکی آگار و بالد آگار کشت داده شده و به مدت 24 ساعت در 32 درجه سانتی گراد گرم خانه گذاری گردیدند. پس از 24 ساعت، با آزمایش مستقیم - رنگ آمیزی گرم - وجود کوکوباسیلهای گرم منفی اسینتوباکتر به طریقه میکروسکوپی تایید شدند.
استخراج DNA و شناسایی مولکولی ایزوله های اسینتو باکتر بومانی DNA ژنومی از ایزوله های رشد یافته در محیط BHI با استفاده از کیت - Genomic DNA Purifucation - استخراج شد. مطابق با دستورالعمل شرکت سازنده - فرمنتاز آلمان - . سپس تستهای افتراقی جهت تشخیص اسینتوباکتر انجام شد. به منظور تایید قطعی اسینتوباکتر بومانی در ایزولههای مورد مطالعه، از آزمایش PCR و - با ردیابی ژن - 16S-23S ribosomal DNA استفاده شد. در حضور زوج پرایمرهای5 استفاده شد.
وجود قطعه 235 جفت بازی تکثیر یافته در این واکنش نشانگر وجود اسینتوباکتر بومانی در کلنیهای مورد مطالعه بود. به منظور دسته بندی ژنتیکی ایزوله های مورد مطالعه از روش RAPD-PCR استفاده شد - 4 - تکنیک Random Amplified Polymorphic DNA-PCR - RAPD-PCR - آزمایش RAPD-PCR با استفاده از پرایمر 5"-GAACAGCTATGACCATG -3" معرفی شده توسط Trajkovska-Dokic و همکاران - 2311 - انجام گرفت - . - 8 در این مرحله واکنش PCR در حجم 28 میکرولیتر شامل 2/8 میکرولیتر PCR buffer 10X، 233 میکرومول dNTP Mix، 1/8 میلی مول MgCl2، 2 میکرومول از پرایمر مربوطه، 2 واحد آنزیم Taq DNA Polymerase، 3 میکرولیتر از DNA هر نمونه تنظیم شد. برنامه حرارتی مورد استفاده در این مرحله شامل یک سیکل 98 درجه سانتی گراد به مدت 4 دقیقه، 43 سیکل تکراری 94 درجه سانتی گراد 1 دقیقه، 25 درجه سانتی گراد 2 دقیقه و 22 درجه سانتی گراد 2 دقیقه و یک سیکل انتهایی 22 درجه سانتی گراد به مدت 13 دقیقه بود.
روش تجزیه و تحلیل آماری
جهت تجزیه و تحلیل اطالعات حاصل از آنالیز روش انجام شده و تعیین فاصله ژنتیکی ایزوله های مورد مطالعه از نرم افزار - NTSYS-pc version 2.02e - استفاده گردید. برای این منظور ابتدا باندهای حاصل از الکتروفورز محصول نشانگر، به صورت دادههای کمی صفر و یک - وجود باند یا عدم وجود باند - ، امتیازدهی شدند. پس از امتیازدهی ژلها، شباهت ژنتیکی بر اساس دادههای صفر و یک با استفاده از ضریب جاکارد و دایس و تطابق ساده محاسبه شدند. به منظور تعیین کارآیی روشهای مختلف تجزیه خوشهای بر مبنای ضرایب تشابه، از ضریب همبستگی کوفنتیک استفاده گردید. سپس برای گروهبندی سویهها تجزیه خوشهای از روش UPGMA بر مبنای ضریب تشابهی که باالترین ضریب همبستگی کوفنتیک را دارا بود، استفاده شد . - 1 -
نتایج
در آنالیز داده های مربوط به شناساگر RAPD از الگوریتم 19 UPGMA و ضریب جاکارد استفاده شد. زیرا در نشانگر RAPD، ضرایب دایس و تطابق ساده دارای ضریب همبستگی کوفنتیک - r - پایینتری - به ترتیب 3/54 و - 3/23 نسبت به ضریب جاکارد - 3/51 - بودند جدول .1 و طبق نتایج حاصل از تصاویر4-1، در دندوگرام حاصل از آنالیز نشانگر RAPD - تصویر - ، همانند نشانگر ERIC مجموع 31 نمونه در دو گروه اصلی A و B تقسیم شدند. که گروه A به دو زیرگروه A1 و A2 تقسیم می شود و در نهایت گروه A1 به چندین زیر گروه تقسیم شد. این در حالی است که گروه های A و B فاقد زیر گروه بودند.
