بخشی از مقاله
چکیده
در این تحقیق به تشخیص همزمان ژنوم دو ویروس با استفاده از در نمونه هاي پلاسما پرداختیم. عفونت با ویروس هاي HIV-1 و HCV از مشکلات بالینی قابل توجه در بیماران مصرف کننده فراورده هاي خونی می باشد.درحال حاضراز روشهاي سرولوژیکی براي تشخیص استفاده می شودکه ممکن است عفونت HIV-1 و HCV در دوره پنجره انتقال پیدا کنند،که در این مرحله عفونت با تستهاي سرولوژیکی قابل تشخیص نمی باشند.
براي این منظور یک روش مناسب وحساس بنام توسعه پیدا کرد.دراین تحقیق قطعات تکثیر شده از ژنوم ویروسها بواسطه اختلافشان در دماي ذوب قابل تمایز می باشندکه بترتیب براي HIV-1 قطعه ازژن pol با طول ودماي ذوب وبرايHCV قطعه از ناحیه5'NCRبا طول 241bpودماي ذوب. 89.5°C همچنین این قطعات از ژنوم دو ویروس در ناقل T/Aبه عنوان کنترل داخلی کلون شدند.براي تایید حساسیت و اختصاصیت،این تست بر روي چندین نمونه ازبیمارانی که به صورت همزمان به این دو ویروس مبتلا بودند و چند نمونه نرمال انجام شد. بدون تردید این روش براي آشکارسازي عفونت بخصوص در حالت co-infection مناسب بوده و روشی حساس و نسبتا ارزان براي تشخبص و غربالگري دهنده گان خون می باشد.
مقدمه
عفونت با ویروس هاي HIV-1 و HCV ، بخصوص در حالت co-infection از مشکلات بالینی قابل توجه در بیماران مصرف کننده فراورده هاي خونی می باشد.بنابراین اطمینان از سلامت فراورده هاي خونی به منظور پیشگیري از شیوع آنها از اهمیت بالایی برخوردار است.عفونت همزمان دو ویروس HIV-1 و HCV در اروپا و امریکا نسبتا شایع بوده و میزان شیوع آن در این مناطق به ترتیب%25 و%10 می باشد
شیوع عفونت در بیماران HIV-1 بیشتراز انتقا ل مادر به فرزند،معتادان تزریقی و انتقال خون یا فراورده هاي خونی مربوط می شود.گذشته ازعفونت همزمان HCV/ HIV-1 ، این دو ویروس از مهمترین عوامل عفونی منتقل شونده بوسیله انتقال خون می باشند.از راهکارهاي قابل توجهی که تا کنون براي ر فع این مشکل ارایه شده و به کاهش میزان انتقال این عوامل عفونی کمک کرده است، می توان به طراحی آزمایش هاي سرولوژیکی حساس براي غربالگري انتی بادي هاي تولید شده علیه اشاره کرد.
سالهاي متمادي است که روشهاي سرولوژیکی بیشترین کاربرد را در زمینه تشخیص عفونتهاي ویروسی دارند و با اینکه روش کشت و جستجوي مستقیم و سریع در اینگونه عفونتها تاکید می شود، با این حال هنوز روشهاي سرولوژیکی می توانند در تشخیص عفونت کمک کننده باشند.ممکن است عفونت HIV-1 و HCV در دوره پنجره انتقال پیدا کنند ، که در این مرحله عفونت با تستهاي سرولوژیکی قابل تشخیص نمی باشند.
از علل دیگر که تستهاي سرولوژیکی کفایت لازم را ندارند می توان به تغییرات آنتی ژنیک ویروس، آلودگی با سروتیپ هاي مختلف ویروس، ناقلان خاموش از نظر ایمونولوژیکی یا ناقلین پنهان و یا نبود آنتی بادي در مراحل اولیه بیماري اشاره کرد.براي کاهش این عوامل، روشهاي مبتنی بر اسید نوکلئیک براي شناسایی اسید نوکلئیک ویروسها توسعه یافته اند.از مزایاي NAT میتوان به بررسی مستقیم و اختصاصیت بسیارزیاد آن براي ژنوم یک عامل عفونی، نسبت به روشهاي سرولوژیک یا روشهاي جداسازي ویروس - به منظور شناسایی آن - اشاره کرد،روشهاي دیگري به عنوان مثال روش چندگانه یا براي تشخیص چند ویروس به صورت همزمان توسعه یافته اند.
از مزایاي این روش می توان به کاهش هزینه ها و همچنین کاهش زمان مورد نیاز براي تشخیص اشاره کرد.از جمله نوآوریهاي ارایه شده در زمینه NAT می توان به تکنیک اشاره کرد که با کمک آن امکان تشخیص چند ویروس به صورت همزمان و دقت بسیار زیاد امکان پذیر می شود.اخیرا این سیستم با نوآوري آنالیز منحنی دماي ذوب ارایه شده است که روشی بسیار ساده، مناسب، سریع و ارزان براي تشخیص و آشکارسازي باکتریها ،پروتوزوآ و ویروسها می باشد.
مواد و روشها
ابتداطراحی پرایمر هاي اختصاصی و مناسب براي تکثیر قطعه کاملا حفاظت شده از ژنوم هر ویروس به گونه اي که تمام ژنوتیپ هاي دو ویروس ذکر شده را شامل شود و در واکنش سازگار باشد انجام شد. نمونه هايبیماران که عفونت همزمان با داشتند و عفونت آنها قبلا بوسیله وسترن بلاتینگ وELISA تایید شده بود در این تحقیق استفاده شد.سپس تخلیص ژنوم دو ویروس از نمونه هاي پلاسماي بیماران انجام شد.
پرایمرهاي الیگونوکلئوتیدي
جهت طراحی پرایمرهاي اختصاصی به منظور تکثیر قطعه کاملا حفاظت شده از ژنوم هر ویروس ، ژن و ناحیه 5’NCR از ژنوم HCV انتخاب شد که به ترتیب طول قطعه حفاظت شده مربوط به و براي می باشد.توالیهاي نوکلئوتیدي کامل هر ژنوتیپ از سایت NCBI تهیه شد و سپس بوسیله نرم افزار هم ردیفی توالیها انجام شد و نواحی حفاظت شده براي طراحی الیگونوکلئوتیدها بدست آمد. علاوه بر این از نرم افزار Oligo 6 براي سازگاري توالی پرایمر ها در استفاده شد.
استخراج RNA ي ویروس ها و تخلیص از پلاسما
نمونه هاي خون بیماران در تیوب هاي حاوي EDTA جمع آوري شد، نمونه ها در سانتریفوژ با دور بمدت گذاشته و پلاسماي به دست آمده تا زمان مصرف در -80 C نگهداري شد.جهت استخراج RNA ویروسهاي ذکر شده از طبق پروثکل کیث استفاده شد.رونوشت برداري معکوس ژنوم ویروس :با استخراج و تخلیص ژنوم RNA ي ویروسها، cDNA طبق دستورالعمل ساخته شد. به منظورحذف هاي ساخته شده ازآنزیم استفاده شدکه به مدت می باشد.سپس cDNA هاي ساخته شده تا موقع استفاده در -80 C نگهداري شدند.
بحث ونتایج
هدف از این تحقیق توسعه تکنیک براي تشخیص همزمان دو ویروسHIV-1 و HCV در نمونه هاي پلاسماي بیماران بود .بدین منظور نواحی حفاظت شده از هر دو ویروس براي تکثیر استفاده شد.ارزیابی غلظت کلرید منیزیم و پرایمر ها و آنزیم Taq pol انجام شد، زیرا فاکتورهاي اساسی در حساسیت و اختصاصیت واکنش هستند.براي تشخیص ژنوم HIV-1 و : HCVما ازاین تکنیک براي ارزیابی تشخیص همزمان دو ویروس HIV-1 و HCV استفاده کردیم.
در اینجا براي تکثیر هر ویروس ناحیه حفاظت شده ایی انتخاب شد، به گونه اي که پرایمرهاي الیگونوکلئوتیدي طراحی شده می توانست تمام ژنوتیپ هاي هر دو ویروس را تشخیص دهد بدون اینکه هیچ واکنشی با دیگر ویروسها و توالی هاي انسانی داشته باشد.شرایط مساعد براي با رقتهاي مختلف از MgCl2 و پرایمرها که داراي بیشترین حساسیت باشد به دست آمد.
