بخشی از مقاله
چکیده
گاستروانتریت حاد یکی از مهمترین عوامل مرگ و میر در دوران کودکی بویژه در کودکان زیر 5 سال میباشد. گاستروانتریت حاد توسط عوامل مختلفی ایجاد میشود که عبارتند از : باکتریها ، ویروسها و انگلها. بسیاری از ویروس ها از جمله روتاویروسها1، آدنوویروسهای تیپ 40و241، نوروویروس ها3 و ساپوویروسها4 میتوانند ایجاد گاستروانتریت نمایند. نورویروسها بعد از روتاویروسها ، یکی از عمدهترین عوامل بیماریزای ویروسی مسئول گاستروانتریت حاد می باشند. نورویروس ها، متعلق به خانواده کلسیویریده5 و ازلحاظ ژنتیکی متنوع میباشند. هدف از این مطالعه تعیین میزان شیوع ژنوگروپI 6 و II نوروویروس در کودکان مبتلا به گاستروانتریت میباشد .
بدین منظور نمونههای مدفوعی - تعداد: 100، پسر 61:، دختر : - 39 از کودکان زیر 5 سال مبتلا به گاستروانتریت جمعآوری شد . تمامی کودکان مربوط به دو بیمارستان بهرامی و علیاصغر - ع - در تهران، ایران بودند. پس از استخراج RNA ویروس، شناسایی RNA نوروویروس با استفاده از روش genogroup specific Real-time RT-PCR انجام شد. عفونت نوروویروسی در 16 نمونه از 100 نمونه جمع آوری شده شناسایی شد 16 - درصد - ، که متعلق به ژنوگروپ II نوروویروس بودند. نتایج ما نشان داد که ژنوگروپ II شایعترین ژنوگروپ در مقایسه با دیگر ژنوگروپهای در حال گردش نوورویروس میباشد.
کلمات کلیدی: گاستروانتریت حاد، نوروویروس، Real time
-1 مقدمه
گاستروانتریت حاد - اسهال - ، به عنوان یکی از مهمترین علائم عفونت دستگاه گوارش مطرح می باشد، که ممکن است با تهوع یا استفراغ، اسهال شدید، کم آبی بدن و در نتیجه مرگ همراه باشد. گاستروانتریت حاد یکی از مهمترین علل مرگ و میر در کودکان کمتر از 5 سال میباشد، بطوریکه بعنوان چهارمین علت شایع مرگ و میر و دومین علت شایع بروز بیماری در کودکان کمتر از 5 سال در سراسر جهان شناخته شده است. بر اساس گزارشات مرکز کنترل و پیشگیری بیماری1 - CDC - ، میزان مرگومیر سالیانه ناشی از این بیماری در جهان به 1/3میلیون نفر در سال 2013 رسیده است. - Lopman et al., - 2015 بیشترین میزان مرگومیر ناشی از گاستروانتریت حاد در کشورهای در حال توسعه رخ میدهد .
این بیماری توسط عوامل مختلفی شامل عوامل عفونی - باکتریها، ویروسها و انگلها - وعوامل غیرعفونی ایجاد میشود، که از این میان ویروسها به عنوان مهمترین عامل ایجادکننده گاستروانتریت حاد شناسایی شدهاند . - Atmar and Estes,2001 - بسیاری از ویروسها میتوانند ایجاد گاستروانتریت حاد نمایند که از شایعترین آنها میتوان به روتاویروسها ، نوروویروسها ، آدنوویروسهای تیپ 40و41 و ساپوویروسها اشاره کرد . - Roodsari et al., 2013 - اولینبار در سال 1972 نورواکویروس2 به عنوان پروتوتیپ جنس نوروویروس، توسط آلبرت کاپیکیان در ایالات متحده امریکا به عنوان عامل اتیولوژیک بیماری گاستروانتریتحاد شناسایی شد. نوروویروسها متعلق به خانواده کلسیویریده بوده و ذرات 30 نانومتری بدون انولوپ3 ، RNA تکرشتهای با سنس مثبت و اندازهای در حدود 7/3 تا 7/5 کیلوباز هستند.. - Thorne - and Goodfellow, 2014
ژنوم نوروویروس از سه قالب خواندن باز، - Open reading frame1 - ORF1 ،ORF2 و ORF3 تشکیل شده است. ORF1 به یک پلیپروتئین غیر ساختاری ترجمه میشود که از بریده شدن این پلیپروتئین، شش پروتئین غیر ساختاری از جمله RNA پلیمراز وابسته به 4RNA ساخته میشود. ORF2 وORF3 نیز به ترتیب، به پروتئین اصلی کپسیدی - - VP15 و پروتئین فرعی کپسیدی - VP2 - ترجمه می شوند . - Thorne and Goodfellow, 2014 - جنس نوروویروسها به 7 ژنوگروپ - genogroup - تقسیم می شود - GI-VII - که GI، GII وGIV انسانها را آلوده کرده و باعث گاستروانتریت حاد میشود . - Lopman et al., 2015 - همچنین، این ژنوگروپها به حداقل 38 ژنوتیپ تقسیم میشوند.تقسیم بندی ژنوگروپ و ژنوتیپ بر اساس تنوع توالی آمینواسیدی پروتئین اصلی کپسید - VP1 - نوروویروس ها میباشد. مطالعات نشان داده است که از بین ژنوگروپ و ژنوتیپهای مختلف، GII.46 فراوانترین و شایعترین ژنوتیپ جدا شده در اپیدمیهای مختلف بودهاست - Kroneman et al., 2013; Karst et al., . - 2014; Wollants et al.,2015
بروز عفونت نوروویروسی مستقل از سن میباشد و تمامی گروههای سنی را تحت تاثیر قرار میدهد، البته در میان کودکان شیوع بیشتری دارد. عوارض شدید این بیماری ازجمله بستری شدن و مرگ در میان کودکان و افراد مسن شایع است - . - Atmar et al., 2015 پیشرفت بیماری 24 تا 48 ساعت پس از ابتلا به عفونت و با شروع حالت تهوع شدید، اسهال ،استفراغ و درد شکم مشخص میشود، اینگونه علائم معمولا در مدت 2 تا 3 روز رفع خواهند شد. همچنین ریزش ویروس را تا سه هفته پس از شروع بیماری در نمونه مدفوع می توان تشخیص داد. هدف از این مطالعه تعیین شیوع ژنوگروپ های I وII نورویروس در نمونههای جمع آوری شده از کودکان زیر پنج سال مبتلا به گاستروانتریت حاد با استفاده از روش genogroup specific Real-time RT-PCR میباشد که نمونههای جمعآوری شده مربوط به دو بیمارستان بهرامی و علی اصغر - ع - در تهران ، ایران میباشند.
-2 مواد و روشها
تعداد 100 نمونه مدفوع از کودکان زیر 5 سال مبتلا به گاستروانتریت حاد ، از دو بیمارستان بهرامی و علیاصغر - ع - در تهران جمعآوری شد که 61 نمونه مربوط به پسرها و 39 نمونه مربوط به دخترها بود. نمونه های جمعآوری شده ابتدا فریز و سپس به آزمایشگاه ویروسشناسی مولکولی انستیتوپاستور ایران ارسال و در دمای -20 درجه سانتیگراد ذخیره شدند. در ادامه از نمونهها یک سوسپانسیون 10 درصد - w/v - با استفاده از بافر - PH=7/4 - PBS 1X تهیه شد. در ابتدا نمونههای مدفوع در بافر PBS به خوبی مخلوط شد و سپس به مدت 15 دقیقه و با دور 1500 g سانتریفوژ انجام شد.
مایع شفاف رویی جمعآوری شد و دردمای -20 درجه سانتیگراد ذخیره گردید. در ادامه برای استخراج RNA ویروس، از کیت استخراج RTP® DNA/RNA Virus Mini Kit - Stratec,Germany - طبق دستورالعمل شرکت تولید کننده، استفاده شد. RNA استخراج شده برای روش Real-time RT-PCR مورد استفاده قرار گرفت. شناسایی ژنوگروپهای I و II نورویروس با استفاده از پرایمر و پروبهای اختصاصی محل اتصال بین ORF1 و ORF2 در ژنوم نوروویروس - Kageyama et al., 2003, Hill et al., - 2010، - جدول - 1 و با کیت SuperScript® III Platinum® One-Step qRT-PCR - Invitrogen, USA - و در دستگاه Corbett Research Rotor-GeneTM - Qiagen, USA - انجام شد.
-4 نتایج
پس از انجام Real-time RT- PCR، نوروویروس در 16 نمونه از 100 نمونه مدفوع جمع آوری شده شناسایی شد که شیوع عفونت نورویروسی 16 درصد گزارش شد - جدول . - 2 همچنین نتایج نشان داد که 9 نمونه از مثبت ها مربوط به پسرها و 7 نمونه مربوط به دخترها بوده است که آنالیز آماری نشان داد که ارتباط معنی داری بین شیوع نوروویروس و جنس وجود ندارد - جدول . - 3 تمامی نمونههای مثبت شناسایی شده ، متعلق به ژنوگروپ II نوروویروس بودند و هیچ نمونه مثبتی از ژنوگروپI نوروویروس شناسایی نشد.
