بخشی از مقاله
چکیده
امروزه پیش انتخاب جنسیت فرزندان دام نشان دهنده، یک پتانسیل بزرگ برای بهبود ژنتیکی و رضایت تقاضای بازار است. مرتب سازی اسپرم توسط دستگاه فلوسیتومتری یک ابزار قدرتمند برای تلقیح مصنوعی و تولید جنین با جنسیت مشخص از پیش تعریف شده فراهم می کند اما تأیید دقیق عملکرد جداسازی اسپرم نیازمند یک نرم افزار برای این روش است و بهبود و اعتبار آن با دیگر فن آوری های تعیین جنسیت مایع منی مرتبط است. اگرچه برای ارزیابی مایع منی تعیین جنسیت شده بایستی با روشی واقع گرایانه که مبتنی بر دستگاه های مشابه با فلوسیتومتر نیستند اقدام کرد تا از خطای رخ داده در جداسازی اسپرم ها جلوگیری کرد. روشهایی برای ارزیابی نسبت جنسی اسپرم در سال های اخیر معرفی شدند. در میان این روشها، روشهای مبتنی بر PCR آسان تر و دقیق تر بودند. از میان این روشها تکنیک ریل تایم PCR بیشتر مورد توجه قرار گرفته است. این روش مزیت های زیادی دارد و برای تعیین نسیت جنسیت اسپرم گاو بسیار مورد استفاده قرار گرفته است اما برای نسیت جنسیت اسپرم گاومیش تاکنون مورد استفاده قرار نگرفته است. تکنیک ریل تایم PCR روشی ساده و مبتنی بر PCR می باشد. این روش تاکنون دقیق ترین، صحیح ترین و حساس ترین روش برای شناسایی و تعیین مقدار اسیدهای نوکلئیک می باشد. با توجه به دقتی که دارد می تواند به طور وسیع جهت تعیین نسبت جنسیت اسپرم مورد استفاده قرار گیرد.
کلمات کلیدی: گاومیش – ریل تایم - PCR تعیین نسبت جنسیت- اسپرم
مقدمه
روشهای تعیین جنسیت اسپرم در حیوانات بزرگ مثل گاو و گاومیش از نظر اقتصادی بسیار مهم است. اسپرم های تعیین جنسیت شده می توانند به تولید جنس خاص مطلوب مورد نظر کمک کند. در نتیجه تولید شیر و یا گوشت را در گله افزایش خواهد داد. تعیین جنسیت اسپرم امکانپذیر است چرا که کل DNAی ژنومی اسپرم های حمل کننده X و Y متفاوت است به طوری که اسپرم های حمل کننده X تقریبا حاوی کروموزوم بیشتری نسبت به اسپرم های حمل کننده Y هستند . - 14 - تعیین جنسیت اسپرم پستانداران قبل از انتخاب با استفاده از روشهای مختلف انجام می شود. این روشها شامل جداسازی بر اساس شیب آلبومین، اتصال اختصاصی آنتی بادیهای مرتبط با جنس، روش شنای رو به بالای اسپرمها، تقسیم بندی بر اساس شیب ناپیوسته پرکل - Percoll - ، الکتروفورز جریان آرام و فلوسیتومتری است . - 6 -
در میان این روشها، فلوسیتومتری از همه روشها دقیق تر است. آخرین روشهای پیشرفته فلوسیتومتر، روشی دقیق و راحت را جهت جداسازی اسپرم های حمل کننده X و Y ارائه داده اند . - 10 - اگر چه برای ارزیابی مایع منی تعیین جنسیت شده بایستی با روشی واقع گرایانه که مبتنی بر دستگاه های مشابه با فلوسیتومتر نیستند اقدام کرد تا از خطای رخ داده در جداسازی اسپرم ها جلوگیری کرد . - 4 - روشهایی برای ارزیابی نسبت جنسی اسپرم در سال 1970 معرفی شدند . - 10 - در میان این روشها، روشهای مبتنی بر PCR آسان تر و دقیق تر بودند. در سال 2004 تکنیک استفاده از ریل تایم PCR توسط جرج و همکاران مورد استفاده قرار گرفت . - 6 - در سال 1996 کمپانی ABI روش تجاری PCR در زمان حقیقی - real-tme qPCR - را با تولید ABI 7700 ارائه نمود. این روش تاکنون دقیق ترین، صحیح ترین و حساس ترین روش برای شناسایی و تعیین مقدار اسیدهای نوکلئیک می باشد.
با استفاده از اختصاصی بودن و حساسیت PCR توام با شناسایی مستقیم محصول در اثر بکارگیری پرایمر، پروب و رنگ های فلئورسنت مشکلات تکنیک های گذشته چون اشکالات آنالیز بر روی ژل، انتقال نمونه ها بر روی غشاء، استفاده از پروب های رادیواکتیو و محدودیت های فیلم حساس به اشعه X به عنوان شناساگر حذف شده است. این سیستم ها از اولیگونوکلئوتیدهای اختصاصی توالی جهت تشخیص محصولات استفاده می کنند و در هر چرخه PCR قادرند میزان تابش فلئورسانس هر نمونه را اندازه گیری کنند و به همین دلیل تشخیص حساس توالی هدف همزمان با افزایش مقدار آن امکان پذیر است.
این روش مزیت های متعددی بر روش های قبلی RT-PCR دارد. مهمترین مزیت آن حساسیت و تکرارپذیری بالای این تست است که سبب می شود مقدار اولیه ی الگو - رونوشت - را از طریق مشاهده ی محصول در حال تکثیر PCR و مشاهده میزان تجمع آن در هر سیکل ارزیابی نمود در حالیکه در سایر روش های PCR محصول نهایی مورد ارزیابی قرار می گیرد. به علاوه این روش بسیار سریع است و امکان ارزیابی بیان چندین رونوشت را بطور همزمان فراهم می کند. آلودگی در این روش نیز بدلیل کاهش دستکاری محصول PCR کمتر می باشد. از طرف دیگر به دلیل انتخاب چرخه های کوتاه، میزان افزایش محصول در این روش - تا 1010 برابر - بسیار بیشتر از روش های دیگر می باشد و این بدان معنی است که رونوشت های با بیان کم را نیز می توان بطور دقیق و تکرار پذیر تعیین مقدار نمود.
این سیستم قادر به تشخیص چندین رنگ فلئورسانس می باشد که امکان بررسی PCR چندگانه و یا استفاده از کنترل های داخلی را فراهم می کند . - 9 - مهمترین مولکولی که به عنوان شناساگر در Real time استفاده می شود ترکیب 6 -کربوکسی فلئورسین - 6-FAM - می باشد که در طول موج 488 نانومتر تحریک می شود و به راحتی امکان الحاق آن به اولیگونوکلئوتیدها وجود دارد. ترکیب شناساگر دیگر با کاربرد فوق SYBR - R - Green I می باشد که در زمان اتصال به DNA دو رشته ای تولید نور فلئورسنت می کند و بر خلاف 6-FAM یک رنگ فلئورسنت آزاد می باشد . - 2 - روش های آزمون ریل تایم PCR شامل الف- روش مبتنی بر کاربرد رنگهای فلئورسنت آزاد و ب- روش های مبتنی بر پروب است.
روش مبتنی بر کاربرد رنگهای فلئورسنت آزاد
ساده ترین روش PCR در زمان حقیقی الحاق یک رنگ آزاد به محصول DNA دو رشته ای در حال سنتز می باشد. مهمترین رنگ فلئورسنت مورد استفاده SYBR Green I می باشد. این رنگ در حالت آزاد در محلول قابلیت تحریک شدن بسیار پایین دارد. در مجاورت DNA دو رشته ای به شیار کوچک DNA متصل و قابلیت تحریک آن افزایش می یابد. این روش به دلیل ارزان بودن رنگ ، آسانی و نیاز به یک جفت آغازگر اختصاصی کاربرد زیادی دارد.
روش های مبتنی بر پروب
در این روش ها از پروب های نشاندار فلئورسنت بجای پرایمرهای نشاندار استفاده می شود. مهمترین مزیت این روش ها حذف سیگنال های اضافی ناشی از تشکیل دایمرهای پرایمر است که در روش های مبتنی بر رنگ های آزاد یا مبتنی بر پرایمر وجود دارد. به علاوه تنها قطعات اختصاصی در ژن با این روش شناسایی می شوند زیرا علاوه بر اختصاصیت پرایمرها، اختصاصی بودن پروب نیز بر ویژگی تکثیر ژن مورد نظر می افزاید. از روش های مبتنی بر پروب می توان پروب های هیدرولیز شونده یا Taq Man را نام برد. این پروب ها بشکل خطی هستند و غالباً در انتهای 5' با رنگ گزارشگر و در انتهای 3' با رنگ خاموش کننده نشاندار می شوند. هنگام مجاورت مولکول های مذکور بر روی پروب سیگنال انتشاری از گزارشگر توسط خاموشگر حذف می شود . - 5 - با توجه به اینکه روشهای تعیین جنسیت بر اساس فلوسایتومتری گران قیمت هستند و معمولا این دستگاه در دسترس نیستند برآن شدیم تا این تکنیک را مورد بررسی قرار دهیم و انرا معرفی نماییم.
مروری بر پژوهشهای انجام گرفته
پاراتی و همکاران - 2006 - دو مجموعه از آغازگرها و پروب های Taq Man داخلی مختص ژن کروموزوم X و Y طراحی کردند. ابتدا این ژنها در پلاسمید کلون سازی شد و برای رسم نمودار استاندارد مورد استفاده قرار گرفت. این روش بوسیله شاخص هایی همچون دقت و تکرارپذیری برای دو سری نمونه مرتب شده - sorted - و نامرتب
