بخشی از مقاله
چکیده
گیاه گوجه فرنگی مورد حمله عوامل بیماریزای متعددی قرار میگیرد که برخی از آنها باعث وارد آمدن خسارت سنگین اقتصادی میگردند. جدایه lycopersic Fusarium oxysporum f. sp. بر روی ارقام مختلف گوجه فرنگی سبب پژمردگی آوندی می گردد. پژمردگی ناشی از فوزاریوم در مناطق گرمسیر و خاک ھای سبک بیشتر متداول میباشد. روش ھای مختلفی جهت تشخیص این قارچ وجود دارند. LAMP روش جدیدی جهت تشخیص پاتوژن ھا می باشد که در آن تمام واکنش ھا می تواند تحت شرایط ھم دما انجام شود و نیاز به تجهیزات گران قیمت ندارد.
در این پژوھش، جهت تشخیص راحتتر و سریعتر این جدایه، بعد از کشت قارچ در محیط کشت PDA، استخراج DNA ژنومی قارچ انجام شد. طراحی آغازگرھا برای ژن RNA ریبوزومی 28s صورت گرفت و به دنبال آن برای اولین بار، واکنشReal time LAMP انجام شد. واکنش با اندازه گیری فلورسنس در حین انجام آن مشخص گردید. از مزایای این روش جدید در مقایسه با سایر روش ھای قبلی می توان به سرعت بالای آن - ٤٥ تا ٦٠ دقیقه - اشاره نمود.
مقدمه
پژمردگی ناشی از فوزاریوم در مناطق گرمسیر و خاک ھای سبک بیشتر متداول میباشد. مطالعات موروفولوژیکی نشان داده است که این گونهھا تفاوت خاصی با یکدیگر ندارند و تمام گونهھای فوزاریوم مولد پژمردگی آوندی را در گونه F.oxysporum جای میدھند - ١ - . این قارچ برحسب قدرت بیماریزایی طبقه بندی شده است - ۴،۶،١٠،۴١ - و جدایه Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersic - FOL - بر حسب قدرت بیماریزایی بر روی ارقام مختلف گوجه فرنگی در سطح نژاد طبقه بندی شده است.
تا به حال سه نژاد به نام ھای - race - 1, 2, 3 برای این جدایه گزارش شده است - ۴١ - . نژاد ١ در سال ۶١٨٨، نژاد ٢ در سال ۵۴١٩ از اوھایو و نژاد ٣ در سال ١٩٧٨ از استرالیا برای نخستین بار گزارش شدند - ۴،۶،١٠ - . FOL بیشترین خسارت را در دمای خاک حدود ◦C٢٧ نشان میدھد - ١١،٩ - . در تحقیقی که توسط رو١ و منزیس٢ انجام گرفت، نشان داده شد که FOL تنها در گونهھای Lycopersicom خسارتزا است - ١١،١٠ - . تکثیر ھم دمای وابسته به حلقه - LAMP - ٣ تکنیک تشخیصی جدیدی است که به عنوان گزینه ای ارزان و بدون کاھش حساسیت و سرعت تکثیر DNA، توسط نوتومی و ھمکاران٤ در سال ٢٠٠٠ پیشنهاد شد - ٧ - . این روش یک DNA پلیمراز و مجموعه ای از ٤ پرایمر اختصاصی، که ٦ توالی مشخص از DNA ھدف را شناسایی می کنند، به کار می گیرد.
روشLAMP سه ویژگی مهم دارد: اولاً تمام واکنش ھا می تواند تحت شرایط ھم دما انجام شود و در مقایسه با PCR معمولی و real-time PCR تجهیزات گران قیمت نیاز نیست. ثانیاً کارایی و حساسیت تکثیر به میزان زیادی بالا است. ثالثاً این واکنش به میزان زیادی اختصاصی است. در خلال ١٠ سال گذشته، روش LAMP به علت سادگی، سرعت، کارایی بالا و اختصاصیت ممتازش، به طور گسترده ای در آنالیز اسیدھای نوکلئیک به کار گرفته شده است - ٥ - . در این پژوھش، برای اولین بار جهت تشخیص سریعتر و راحتتر این قارچ روش مولکولی Real time LAMP به کار گرفته شد.
مواد و روشھا
در ابتدا جدایه مورد آزمایش در محیط کشت PDA رشد داده شد و پرگنه قارچ جهت استخراج DNA ژنومی آماده شد. به منظور نگهداری درازمدت جدایه، در شرایط استریل حلقهھایی به قطر ۵ میلی متر توسط چوب پنبه سوراخ کن برداشته و به لولهھای شیشه ای درپوش دار حاوی ماسه استریل منتقل شد. لولهھای شیشه ای به مدت یک ھفته در دمای اتاق نگهداری و سپس در دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری شد - ٢،٣،١١ - . برای تهیه محیط کشت سیب زمینی دکستروز آگار - PDA - ابتدا میزان ٢٠٠ گرم سیبزمینی پوست کنده در داخل بشر ریخته شد و بر روی منبع حرارتی قرار گرفت و پس از پخته شدن، عصارة آن با پارچه ململ گرفته شد. عصاره مذکور به ھمراه ٢٠ گرم دکستروز و ١٨ گرم آگار در داخل ارلن ریخته و حجم محلول با آب مقطر به یک لیتر رسانده شد.
سپس محلول بر روی منبع حرارتی قرار داده شد تا آگار و دکستروز در داخل آب حل شود و محلول یکنواختی بدست آید. سپس به مدت ٢٠ دقیقه تحت فشار ١ اتمسفر و دمای ١٢١ درجه سانتیگراد اتوکلاو شد. به منظور استخراج DNA ژنومی میزان ml۵/٠ از مسیلیوم قارچ ۵ روزه در محیط کشت PDA، به داخل تیوب ml۵/١ انتقال داده شد و با ریختن نیتروژن مایع روی آن با اسپات چول خرد گردید. µl٠٠۵ بافر لیز کننده - 50mM Tris, 50mM EDTA, 3%SDS, 1% BME, ./1 mg/ml K - proteinase اضافه گردید.
محلول در ۵۶ درجه سانتیگراد به مدت یک ساعت انکوبه شد. بعد از این مدت µl٠٠۵ فنول به محلول اضافه و مخلوط گردید و با دور ×g٣٠٠ به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ شد. بعد فاز رویی را برداشته و به تیوب جدید انتقال داده و µl٠٠۴ کلروفورم ایزوآمیل الکل به نسبت ۴٢ به ١ به آن اضافه و مخلوط گردید. سپس سانتریفیوژ بر اساس شرایط قبلی مجدداً صورت گرفت. فاز رویی دوباره به تیوب جدید منتقل و µl٠٠۴ آمونیوم استات M ۵/٧ به ھمراه µl٠۵ اتانول مطلق اضافه و در ٢٠- درجه سانتیگراد به مدت ٣٠ دقیقه انکوبه گردید. سپس سانتریفیوژ با دور ×g٠٠۵١ به مدت ٢٠ دقیقه انجام شد. فاز رویی دور ریخته و رسوب حاصله با الکل ٧٠ درصد شستشو داده شد. بعد از خشک شدن، رسوب در µl٠۵ آب مقطر دو بار استریل حل گردید.
طراحی آغازگر برای ژن RNAریبوزومی 28s با کد دسترسی HM057281.1 برای جدایه FOL با استفاده از نرم افزارPrimerExplorer V.4 انجام گردید. واکنشReal time LAMP در حجم نهایی μl٢٥ μl - ٥ DNA، μl٢ آغازگر pmol FIP٢٠، μl٢ آغازگر pmol BIP٢٠، μl٥/٠ آغازگر pmol F3٥، μl٥/٠ آغازگر pmol B3٥، μl٢ بتائین mM١٠، μl١ آنزیمBst DNA پلیمراز، μl٥/٢ بافر X Bst١٠، μl٥ SYBR® Premix Ex TaqTM - Perfect Real TIME, TAKARA Bio Co, LTD, RR081A - II و μl٥/٧ آب استریل - در دمای ˚C٦٠ به مدت ٦٥ دقیقه و ˚C٨٠ به مدت١٠دقیقه ادامه یافت.
نتایج و بحث
جدایه مورد نظر در محیط کشت PDA کشت شد و بعد از ۵ روز از میسیلیوم ھای ۵ روزه استخراج ژنوم صورت گرفت. آغازگرھا با استفاده از برنامه PrimerExplorer V.4 برای ژن RNA ریبوزومی 28s طراحی شد و واکنش Real time LAMP با استفاده از این آغازگرھا انجام شد.
