بخشی از مقاله
چکیده:
مهندسی ژنهاي کدکننده پروتئینهاي ضد قارچی در گیاهان مثل ژن کیتیناز - Chi - ، مقاومت این گیاهان را در برابر پاتوژن هاي قارچی افزایش میدهد. بررسی و تعیین تعداد ژن وارد شده به ژنوم گیاه ترارخته از آن جهت مهم است که بر اساس آن میتوان پایداري ژن و پایداري بیان ژن مورد نظر را طی چندین نسل پیشبینی نمود.
براي انجام این بررسی روشهایی وجود دارد، از جمله تکنیک Southern Blot که یکی از روشهاي رایج براي تخمین تعداد نسخه ژنها میباشد، ولی این تکنیک بسیار وقتگیر و پر زحمت است. در این پژوهش از تکنیک Real-Time PCR براي رسیدن به هدف فوق استفاده شد که مشکلات تکنیکهاي قدیمی را نداشته و بسیار حساس و اختصاصی عمل میکند.
مقدمه:
پنبه - Gossypium spp. - از محصولات مهم کشاورزي بوده که عملکرد آن توسط آفات و بیماريهاي مختلف کاهش می یابد. تولید ارقام مقاوم با استفاده از تکنیکهاي مهندسی ژنتیک توانسته است تا حد بسیار زیادي عملکرد این گیاه را افزایش دهد. در این تکنیک ها ژن هاي مفید با استفاده از روشهاي متداول انتقال ژن به گیاه مورد نظر منتقل می شود
از جمله ژن هاي منتقل شده به گیاه پنبه، ژن کیتیناز است که باعث ایجاد مقاومت گیاه به بیماري قارچی پژمردگی ورتیسیلیومی یا پژمردگی آوندي می شود. بعد از انتقال ژن مورد نظر به گیاه، یکی از آنالیزهاي مولکولی بر روي گیاهان تراریخته، بررسی و تعیین تعداد ژن وارد شده به ژنوم گیاه میباشد . اطلاع از تعداد نسخه ژن وارد شده به این دلیل حائز اهمیت است که هر چه تعداد نسخه بالاتر باشد احتمال خاموشی نیز بیشتر است.
بنابراین اگر تعداد گیاهان تراریخته زیاد باشد، الویت در انتخاب با گیاهانی است که نسخههاي کمتري از ژن مورد نظر را داشته باشند
براي این منظور روشهایی وجود دارد که این روشها به دلیل مشکلات تکنیکی و فنی نمیتوانند این نیاز را به خوبی تأمین کنند. براي مثال تکنیک سادرن بلات براي تعیین تعداد نسخه هاي ژن منتقل شده به زمان وحجم کار زیادي نیاز دارد و براي مقادیر زیاد DNA کارایی خوبی ندارد
کمیت سنجی توسط تکنیک Real-Time PCR با دو روش مطلق و نسبی انجام میشود. بکارگیري روش کمیت سنجی نسبی بر پایه استفاده از یک ژن کنترل داخلی است. ژن کنترل داخلی بکار گرفته شده باید داراي مشخصات و خصوصیاتی باشد که عبارتنداز : باید در هر ژنوم به تعداد کم موجود باشد، یعنی تعداد نسخه پایینی به ازاي هر ژنوم هاپلوئید داشته باشد. این ژن باید از هتروژنیسیته پایین در بین رقمها برخوردار باشد و در عوض داراي هموژنیسیته پایینی در مقایسه با سایر گیاهان باشد
براي انجام کمیت سنجی نسبی، روش Delta Delta Ct که توسط Livak و همکاران در سال 2001 معرفی گردیده، نسبت به سایر روشهاي کمیت سنجی، روش نسبتاً ساده و راحتی است . - 2 - در این تحقیق نتایج تکنیک Real-time PCR جهت تعیین تعداد نسخه ژن کد کننده کیتیناز وارد شده به گیاه پنبه تراریخته به روش کمیت سنجی نسبی با سیستم TaqMan و با استفاده از ژن TPS به عنوان ژن کنترل داخلی گزارش میشود.
مواد و روشها:
در این تحقیق از نمونههاي گیاهی پنبه تراریخته حاوي ژن Chi در نسل سوم و در دو لاین 10/11 و 11/57، استفاده شد. استخراج DNA از برگهاي تازه پنبه با استفاده از روش هایوان - 2001 - که اختصاصی براي گیاه پنبه است انجام گردید. از ژن TPS که کد کننده آنزیم ترهالوز -6فسفات سنتاز است به عنوان ژن کنترل داخلی استفاده شد. این ژن داراي یک نسخه در هر ژنوم هاپلوئید میباشد و همچنین داراي هتروژنیسیته پایین در بین ارقام پنبه زراعی و هموژنیسیته پایین در رابطه با سایر گیاهان میباشد
براي طراحی آغازگرها و پروب، جهت استفاده در تکنیک Real-Time PCR از نرمافزار BeaconDesigner 7.0 استفاده شد. در مورد ژن Chi توالی آغازگر رو به جلو 5’-GAGCCTGCCCAGCCAAAG-3’، توالی آغازگر رو به عقب 5’-CCGTGTCTCCGGTGTTTCC-3’ و توالی پروب اختصاصی این ژن 5’-Fam-TG CCTTCATCGCCGCCGCCAA-BHQ1-3’ و براي ژن TPS توالی آغازگر رو به جلو 5’-ACGAACTTTCCCA TTTCCTTTCG-3’، توالی آغازگر رو به عقب 5’-CGAGAAGGAGATACTTACTTGCAG-3’ و توالی پروب این ژن 5’-Tet-CCCACAAATCCGCCTCTCCTCCGC-BHQ1-3’ بود. پس از اینکه غلظت آغازگرهاي ژن Chi با آغازگرهاي ژن TPS بهینه سازي شدند، واکنش Multiplex Real-time PCR در 40 چرخه و هرچرخه شامل 10 ثانیه واسرشته شدن در دماي 94 درجه و 30 ثانیه چسبیدن آغازگرها در دماي 60 درجه سانتیگراد انجام شد.
هر 20 میکرو لیتر مواد واکنش شامل 2 میکرولیتر 25 - MgCl2 میلیمولار - ، 2 میکرولیتر بافر - 10X - PCR، 1/6 میکرولیتر مخلوط dNTPs 10 - میلیمولار - ، یک واحد آنزیم Taq Polymerase، 2میکرولیتر DNAي گوال با غلظت حدوداً20 نانوگرم بر میکرولیتر، آغازگرهاي رو به جلو و رو به عقب براي ژن Chi هرآغازگر 0/2 میکرولیتر 200 - میلیمولار - ، آغازگرهاي رو به جلو و رو به عقب براي ژن TPS هر آغازگر 0/2 میکرولیتر 200 - میلیمولار - و پروب براي هر یک از دو ژن 0/2 میکرولیتر 100 - میلی مولار - بود.
نتایج و بحث:
نمونههاي استاندارد براي ژن Chi از DNAي پلاسمید حامل این ژن و براي ژن TPS از گیاه شاهد غیرتراریخته ایجاد شد و بازده تکثیر براي هر دو ژن با رسم نمودار استاندارد بررسی شد. شکل 1 منحنیهاي تکثیر و نمودار ارزیابی مربوط به نمونه هاي استاندارد حاوي ژنهاي Chi را نشان میدهد. ضرایب تبیین گزارش شده براي نمودار استاندارد در این مطالعه بیش از 0/999 بوده است که نشانگر بالا بودن سطح دقت و توانایی تخمین تعداد نسخههاي ژن Chi است. براي اینکه نتایج Real-time PCR را از نظر دقتو تکرارپذیري ارزیابی کنیم، آزمایش دو مرتبه تکرار گردید.
شکل .1 منحنیهاي تکثیر و نمودار ارزیابی تکثیر براي سري رقت نمونههاي استاندارد ژن Chi در سیستم TaqMan
دادههاي مربوط به تکرارپذیري آزمایشات نشان میدهند که تغییرات بین آزمایشات بسیار کم بوده و این سیستم براي تعیین تعداد نسخه ژنهاي مورد نظر، تکرارپذیر و قابل اعتماد میباشد. منحنیهاي مربوط به تکثیر ژنهاي Chi و TPS در نمونه هاي DNA پنبه تراریخته به ترتیب در شکل 2 آورده شده است. کنترل منفی براي تکثیر ژن Chi، DNAي گیاه پنبه غیرتراریخته و براي تکثیر ژن TPS، یکی از نمونههاي استاندارد حاوي ژن Chi - پلاسمید - انتخاب شد.
در روش Delta-Delta Ct، از کی نمونه که تعداد نسخه آن قبلاً توسطکتنیک سادرن بلات و همچنین روش کمیت سنجی مطلق بدست آمده بود، به عنوان سنجشگر یا کالیبراتور استفاده شد و با استفاده از فرمولهاي ارائه شده توسط Livak و همکاران - 2001 - ، تعداد نسخه ژنهاي مورد نظر در ژنوم هاپلویید نمونهها بررسی گردید که نتایج مربوطه در جدول 1 آورده شده است. به علت اینکه تعداد نسخه مربوط به ژن TPS در ژنوم هاپلویید پنبه برابر با یک نسخه است - 6 - ، پس نتایج تعیین تعداد نسخه ژن Chi مربوط به ژنوم هاپلویید بوده و میتوان از این دادهها براي تعیین تعداد نسخه در ژنوم تتراپلویید پنبه استفاده نمود
شکل .2الف. منحنیهاي مربوط به تکثیر ژنهاي Chi در نمونههاي DNA پنبه تراریخته توسط تکنیک Real-time PCR
ب. . نمودارهاي مربوط به تکثیر ژن TPS در نمونههاي DNA پنبه
