بخشی از مقاله
چکیده
قطعات برگ و مریستم هاي جداشده از گیاهچه هاي 7 روزه گیاه اطلسی بومی با اگروباکتریوم سویه LBA4404 حاوي پلاسمید pBI121 که حاوي ژن نشانگر بتاگلوکورنیداز - gus - و ژن پیرولین -5 کربوکسیلات سنتاز - p5cs - تحت کنترل پیشبر CaMV35S و ژن نئومایسین فسفوترانسفراز - nptII - تحت کنترل پیشبرNOS بود همکشت گردید. بعد از 4 روز نمونه ها ي همکشت به محیط شاخه زایی حاوي 500 میلی گرم در لیتر سفوتاکسیم و 200 میلی گرم در لیتر کانامایسین منتقل شد و کشت ها در دماي 25±2 درجه سانتی گراد و 16 ساعت روشنایی با شدت 40 میکرو مول بر مترمربع بر ثانیه - μmol m-2s-1 - نگهداري شدند. سه هفته بعد ، انتقال ژن هاي مارکر gus و nptII و همچنین ژن هدف p5cs در شاخساره هاي تولید شده توسط واکنش زنجیره اي پلی مراز ،آزمون هاي هیستوشیمیایی و بیوشیمیایی تأئید گردید و سپس گیاهان تراریخت در شرایط تنش سرما - 4° C - مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج بدست آمده نشان داد که مریستم ریز نمونه کارا و مناسب براي تراریختگی اطلسی بومی می باشد.
مقدمه
گیاهان همواره در معرض تغییرات محیط قرار دارند و به منظور بقاء ناگزیر از به کار بردن مکانیزمهایی براي درك تنش هاي محیطی و پاسخ به آنها است. یکی از پاسخهاي عمومی گیاهان به تنش تولید و تجمع اسمولایتهایی مثل اسید آمینه پرولین میباشد. پرولین اسید آمینهاي است که در دامنه وسیعی از گیاهان و میکروارگانیسمها در پاسخ به تنشهاي اسمزي نقش دارد - . - 8 تجمع این اسمولیت در سیتوزول در سلول گیاهی امکان تعدیل فشار اسمزي را فراهم می نماید - 6 - و در حفظ ساختار شکل سه بعدي طبیعی پروتئین ها و پایداري ساختمان غشاء نقش دارد . - 6 - در گیاهان آنزیمی با دو فعالیت متابولیکی به نام دلتا -پرولین--5کربوکسیلات سنتتاز - P5CS - وجود دارد که آنزیم کلیدي مسیر سنتز اسید آمینه پرولین است.
مواد و روشها مواد گیاهی و باززایی:
بذوراطلسی ایرانی پس از ضدعفونی در هیپوکلریت سدیم 1/5 درصد، در محیط کشت جوانه زنی MS کشت گردید. یک هفته بعد از جوانه زنی، مریستم به همراه دو برگ پریموردیا با استفاده از روش گلد - 3 - جداسازي و به محیط پایه + MS ویتامینهاي B5 و غلظت مناسب 1BAP - یک میلی گرم در لیتر - منتقل گردید. مریستم هایی که تولید ساقه و برگ نمودند به محیط ریشه زا حاوي 0/1 میلی گرم در لیتر 2 NAA انتقال و در نهایت گیاهچه هاي ریشه دار شده به گلدانهاي حاوي ترکیب مساوي حجمی از ماسه، پرلایت و ورمیکولایت منتقل شدند. به منظور باززایی از قطعات برگ، از برگهاي جوان و سالم گیاه قطعاتی به ابعاد 10×10 میلی متر تهیه و در محیط کشت هاي MS تغییریافته که داراي 1 میلی گرم در لیتر 1Zea، 2 میلی گرم در لیترBAP و 0/1 میلی گرم در لیتر - MS1 - NAA و همچنین 2 میلی گرم در لیتر BAP و 0/1 میلی گرم در لیتر - MS 2 - NAA بود، به ترتیب قرار داده شدند.
انتقال ژن:
به منظور تراریخت اطلسی از اگروباکتریوم سویه 2 LBA4404 حاوي پلاسمید pBI121 استفاده گردید. پلاسمید pBI121داراي ژن نشانگر بتاگلوکورنیداز - gus - و ژن پیرولین -5 کربوکسیلات سنتاز - p5cs - تحت کنترل پیشبر CaMV35S و ژن نئومایسین فسفوترانسفراز - nptII - 3 تحت کنترل پیشبر - NOS - بود. باکتريها در محیط LB مایع در دماي 28 درجه سانتی گراد روي شیکر با دور 150 rpm به مدت یک شبانه روز رشد داده شدند . زمانی که OD600= 0/7 گردید، ریزنمونه هاي مریستم که از قبل به مدت 2 روز در محیط شاخه زایی در دماي 25±2 درجه سانتی گراد m-2 mol s -1 40μ روشنایی 16 ساعته کشت گردیده بودند، هر کدام با 5 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتري همکشت و به مدت 48 ساعت در محیط شاخهزایی فاقد آنتی بیوتیک در شرایط 16 ساعت روشنایی و 8 ساغت تاریکی در دماي 25±2 درجه سانتی گراد نگهداري شد. سپس نمونهها در همین محیط به مدت 2 روز دیگر واکشت شدند.
بعد از دو روز ریزنمونههاي هم کشت با اگروباکتریوم در محیط انتخابی - محیط شاخه زایی به همراه 500 میلی گرم در لیتر سفوتاکسیم و 200 میلی گرم در لیتر کانامایسین - واکشت شد. بعد از یک ماه مریستم هایی که در محیط انتخابی زنده و تولید شاخ و برگ نموده بودند به عنوان گیاه تراریخت انتخاب و به محیط ریشه زا MS - تغییر یافته 0/1 + میلی گرم در لیتر - NAA منتقل شد. به منظور انتقال ژن با استفاده از قطعات برگ، جداکشتهاي برگ با اگروباکتریوم هم کشت و به محیط هاي شاخهزایی MS1 و MS2 منتقل شد. بعد از سه روز قطعات برگ به محیط انتخابی محتوي 500 میلی گرم در لیتر سفوتاکسیم و 50 میلی گرم در لیتر کانامایسین انتقال وساقههایی که در محیط ریشه زایی با 0/1 میلی گرم در لیتر NAA ریشه دار شدند جهت سازگاري به گلدان هاي حاوي نسبت هاي حجمی مساوي از ماسه، ورمیکولایت و پرلایت انتقال یافتند.
آزمایش سنجش :GUS
برشی از برگ و ساقه هر یک از گیاهان تراریخت به همراه گیاهان غیرتراریخت به عنوان کنترل منفی تهیه گردید و در سوبستراي X-gluc با pH معادل 7 در دماي 37 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت قرار داده شدند . - 2 - در ادامه با از بین بردن رنگ کلروفیل با الکل اتانل 100 درصد رنگ آبی حاصل از واکنش سوبسترا با آنزیم GUS در گیاهان تراریخت ظاهر گردید.
آزمایش سنحش پرولین:
مقدار 100 میلی گرم برگ تازه گیاه تراریخت توسط نیتروژن مایع پودر شد ، سپس 10 میلی لیتر اسید سولفوسالیسیلیک %3 به آن اضافه شد. محلول حاصل را 10 دقیقه در 13000 دور در دقیقه سانتریفوژ و 2 میلی لیتر از محلول بالایی را به همراه 2 میلی لیتر از محلول 1/25 - Nynhydrin acid گرم Nynhydrin acid را به 30 میلی لیتر اسید استیک اضافه کرده و 20 میلی لیتر اسید اورتو فسفوریک به آن اضافه شد - و 2 میلی لیتر اسید استیک با هم مخلوط کرده به مدت یک ساعت در 100 درجه سانتی گراد در حمام آب گرم قرار گرفت. سپس براي اتمام واکنش لوله هاي حاوي محلول ، در آب صفر درحه قرار داده شد، سپس لوله ها را در محیط آزمایشگاه قرار داده و 4 میلی لیتر تولوئن به محلول اضافه شد و ورتکس گردید .پس از کالیبره کردن دستگاه، جذب نمونه ها در 520 نانومتر خوانده شد . - 1 -
آزمون :PCR
DNA از گیاهان تراریخت به روش 1CTAB استخراج گردید - 7 - و واکنش زنجیره اي پلی مراز DNA گیاهان تراریخت با آغازگرهاي اختصاصی ژن p5cs انجام گرفت و محصول PCR روي ژل آگاروز 1/2 درصد به همراه نشانگر مولکولی الکتروفورز شد.
نتایج و بحث:
در این بررسی از دو نوع ریزنمونه مریستم انتهایی و قطعات برگ به منظور باززایی گیاه اطلسی بومی و بهینه سازي سیستم انتقال ژن استفاده گردید. قطعات برگ به صورت مستقیم در محیط MS1 تولید ساقه نمودند - 5 - اما پس از آغشته شدن با اگروباکتریوم در این محیط به دلیل وجود کانامایسین، درصد تراریختگی بسیار کمی 0/1 - در صد - نشان داد. نتایج تراریختگی با استفاده از مریستم به همراه پریموردیا نشان داد که زمان کمتري براي باززایی - حدود 4 هفته - لازم است.
درصد تولید گیاهچههاي تراریخت و شبیه به اصل حاصل از ریزنمونه مریستم در مقایسه با ریزنمونه برگ بیشتر بودتقریباً - 20 درصد - . یک میلی گرم در لیتر هومون BAP در اطلسی ایرانی نیز موجب باززایی تعداد زیادي شاخههاي مستقیم و القاي چند جوانهايها2 شد که با نتایج پژوهش هاي انجام شده با رقم اطلسی هاي خارجی - 5 - و اظهار اینکه باززایی از طریق مریستم انتهایی به ژنوتیپ وابسته نیست مطابقت دارد.
- 4 - نتایج آزمون هیستوشیمیایی ژن gus روي گیاهان تراریخت نسبت تراریختگی بالایی در گیاهان باززا شده از مریستم نسبت به قطعات برگتقریباً - 70 درصد - نشان داد. واکنش زنجیره اي پلی مراز وجود ژن p5cs را در اطلسی هاي تراریخت تأیید کرد - شکل . - 1 ونتایج آزمون بیوشیمیایی پرولین نشان داد که مقدار پرولین در گیاهان تراریخت در شرایط تنش سرما - سه روز تنش سرما در چهار درجه سانتی گراد - بیشتر از گیاهان شاهد بود - شکل . - 2 این نتایج با پژوهش هاي پیلججی و همکاران در - سال - 2001 که دریافتند p5cs موجب مقاومت به سرما در کاهو می شود مطابقت داشت . - 8 - نتایج این بررسی نشان داد که ریزنمونه مریستم به جهت کاهش دادن مدت زمان تراریختگی و افزایش تولید گیاهان تراریخت در اطلسی ایرانی نسبت به قطعات برگ برتري دارد. همچنین به نظر می رسد که اندازه مریستم عامل مهمی در موفقیت باززایی و تراریختگی این رقم باشد.
