بخشی از مقاله
مقدمه
اتیلن یک مولکول دوکربنی ساده گازي است که در بسیاري از جنبههاي تکوینی و رشد گیاه دخالت دارد .(2)
پیري بافت گل فرآیندي است که اتیلن نقش کلیدي در آن ایفاء میکند. در بسیاري از محصولات با ارزش به لحاظ اقتصادي، سنتز اتیلن در پاسخ به تنشهاي مختلف و فرآیندهاي تکوینی القاء میشود. همچنین در زمان
گردهافشانی در گیاهان کلیماتریک یک افزایش سریع در سنتز اتیلن مشاهده میشود که بسیاري از فرآیندهاي مرتبط با پیري و مرگ سلولی را در گیاهان هماهنگ میکند .(7)
مطالعه بسیاري از گونههاي گیاهی نشان داده که مسیر بیوسنتز، دریافت و انتقال پیام اتیلن کاملاً محافظت شده بوده و با واسطه سازوکارهاي تنظیمی مناسب در طول
572
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 4، 1392
چرخه زندگی گیاه به دقت تنظیم میشوند. تا به امروز بررسیها نشان داده که عوامل مختلفی داراي نقش تنظیمی روي فرآیند پیري القاء شده توسط اتیلن میباشند. با این حال اگرچه وجود این نقش تنظیمی اثبات شده است اما سازوکار عمل این فاکتورها در فرآیند پیري در بافت گلبرگ یا اندامهاي زایشی گل بهویژه بعد از گردهافشانی مورد مطالعه قرار نگرفته و هنوز به درستی روشن نشده است. بررسی و مطالعات مولکولی اخیر منجر به شناسایی
و درك سازوکار تنظیم تعدادي از ژنهاي درگیر در واکنشهاي متقابل بین اتیلن با مسیر انتقال پیام سایر هورمونها و فاکتورهایی نظیر قندها، 5) ABA، 16، 17، 32
و (36، اکسین 6)، 42 و (52، سیتوکنین 9)، 11 و (43 و نور (55) گردیده است.
مطالعات ژنتیکی موتانتهاي آرابیدوپسیس بهویژه مطالعات اپیستازي نشان داده که رسپتورهاي etr1، etr2، ein4، به همراه همولوگ آنها یعنی ers1، ers2 بالادست ژن
ctr1 و بعکس ein2، ein3 ، ein5 و ein6 در پاییندست مسیر انتقال پیام و ژن ctr1 عمل میکنند .(41) آنالیز دقیق این موتانتها، به علاوه جداسازي و تعیین خصوصیات برخی ژنهاي مربوطه در حال حاضر یک دید کلی از ماهیت پیچیده مسیر انتقال پیام اتیلن در گیاهان فراهم نموده است. عقیده بر این است که رسپتورهاي اتیلن در یک مسیر پیچیده انتقال پیام با ctr1 بهعنوان یک کایناز احتمالی در ارتباط میباشد .(19) به نظر میرسد فعالیت کاینازي ctr1 مربوط به ناحیه C ترمینال پروتئین بوده که با سرین/ترئونین پروتئین کاینازهاي خانواده پروتئینی Raf
تشابه دارد .(26) مشابه نقشی که Raf کاینازها در پستانداران دارد، ctr1 احتمالاً یک MAP کایناز کایناز کایناز (MAPKKK) بوده و مهار سیگنال اتیلن احتمالاً از طریق یک آبشار MAPKK و MAPK پیچیده صورت میگیرد 26) و .(30 شواهد اخیر نشان داده که تیمار با پیش ماده اتیلن (ACC) منجر به تحریک آبشار MAPK در آرابیدوپسیس و فعال شدن ctr1 میگردد. این آبشار
احتمالاً پروتئینهاي MAPKK، SIMKK، MAPK، MAPK6 و ... را درگیر میکند .(34) با این حال بررسیهاي اخیر نشان داده که موتانتهاي MPK6، نقص قابل سنجش در مسیر انتقال پیام اتیلن بروز نمیدهند که این موضوع احتمالاً ناشی از کارکرد موازي سایر اجزا مسیر انتقال پیام میباشد. مطالعات قبلی نیز به نقش کلیدي ACC
بهعنوان سیگنال احتمالی اولیه در آغاز فرآیند پیري اشاره کردهاند 49)، 50 و .(51
اعتقاد بر این است که آبشار MAPK به طور مستقیم یا غیرمستقیم، پروتئین غشایی EIN2 را فعال میکند .(34)
پروتئین EIN2 داراي یک ناحیه N ترمینال هیدروفوب میباشد که داراي 12 هلیکس بین غشایی با همولوژي به خانواده پروتئینی NRAMP میباشد. بخش C ترمینال پروتئین ein2، (به جز یک موتیف (Coiled-coil کاملاً منحصر به فرد بوده و هیدروفیلیک میباشد، که نشاندهنده محلول بودن و سیتوزولی بودن آن میباشد. علاوهبراین به نظر میرسد این ناحیه در اثرات متقابل پروتئین-پروتئین در سایر ارگانیسمها نیز نقش دارد .(3) البته تا به امروز ژن
ein2 از گیاهان آرابیدوپسیس (3)، برنج (25)، اطلسی((37،
توتون (میرشمسی و همکاران، مقاله در دست چاپ)، و ذرت (15) جداسازي شده است. کارکرد ein2 در انتقال پیام اتیلن کاملاً شناخته شده نیست. تنها از طریق مقایسات انجام شده با پروتئینهاي NRAMP چنین فرض شده است که ناحیه درون غشایی پروتئین EIN2 بهعنوان یک ترانسپورتر کاتیونهاي دو ظرفیتی عمل میکند .(3) با این حال، تا به امروز خصوصیاتی مبنی بر اتصال به کاتیونهاي فلزي یا ویژگی انتقال یونهاي فلزي در این پروتئین شناخته نشده است. موتانتهاي نول ein2 غیرحساس به اتیلن بوده، درحالیکه موتانتهایی که ناحیه C ترمینال ein2 در آنها بیش بیان شده بود، پاسخ سهگانه دائم به اتیلن نشان دادند 3) و .(20 این دادهها نشان میدهد که ein2 انتقال پیام اتیلن را موجب شده و تنها زمانی فعال است که اتیلن به رسپتورهاي اتیلن باند شده باشد .(3) ناحیه N ترمینال و
573
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 4، 1392
ناحیه C ترمینال پروتئین EIN2 براي کارکرد این پروتئین ضروریست. این نتایج مبین آن است که ناحیه N ترمینال پروتئین EIN2 براي درك پیام اتیلن از اجزاي بالادست مسیر انتقال پیام ضروریست. بعکس ناحیه C ترمینال براي انتقال این سیگنال به اجزاي پاییندست مسیر انتقال پیام اتیلن ضروري و کافی است .(3) بررسیهاي انجام شده نشان داده که ein2 از طریق یک مکانیسم ناشناخته، فاکتورهاي رونویسی خانواده ژنی ein3 را فعال میکند. ژن القاء شونده توسط اتیلن erf1، بهعنوان تنها هدف شناخته شده براي ein3 محسوب میشود. دایمرهاي ein3 با یک ناحیه پالیندرومیک تکراري منحصر به فرد در پروموتر erf1
اثر متقابل نشان میدهند و به صورت فعال کننده و مهار کننده رونویسی عمل میکنند .(40) مطالعه و بررسی روي موتانتهایی نظیر ein2 نشان داده که مسیر انتقال پیام اتیلن احتمالاً با سایر مسیرهاي انتقال پیام مرتبط با پیري نظیر اکسین (14)، سیتوکنین (10) و جاسمونیک اسید (35)،
آبسزیک اسید (17) هم اثر متقابل دارد. مطالعات انجام شده روي برخی موتانتهاي آرابیدوپسیس نظیر abi1‐1،
era3‐1، era3‐3 و شناسایی آللهاي موتانت ein2 و ctr-1
شواهدي را فراهم نموده که نشاندهنده وجود اثرات متقابل مسیر انتقال پیام اتیلن با ABA است 5) و .(17 اگرچه نقش ABA در زمان فرآیند پیري گلبرگ در گیاهان حساس به اتیلن نیز هنوز به درستی شناخته نشده است. با این حال در مجموع به نظر میرسد کاربرد ABA خارجی، از طریق القاءء سنتز اتیلن در ژینوئسیوم عمل میکند 31) و .(38 علاوه بر این شواهد به دست آمده اخیر نشان میدهد که سازوکارهاي مرتبط با قندها، یک نقش مهم بهویژه در تنظیم اثرات ABA و اتیلن در زمان جوانهزنی بذور، رشد ریشه و فرآیندهاي درگیر در پیري و مرگ سلولی بازي میکنند 16) و .(36
آنالیز ژنتیکی موتانتهاي gin و glo مسیر انتقال پیام گلوکز را در آرابیدوپسیس و تداخل عمل بین مسیر انتقال پیام هورمونهاي گیاهی و گلوکز بهعنوان یک سیگنال اولیه در
بسیاري از فرآیندهاي فیزیولوژیک خصوصاً گلدهی و پیري را نشان میدهد 12) و 36 و 39 و .(56 شواهد موجود نشاندهنده نقش تنظیمکنندگی گلوکز بهعنوان یک آنتاگونیست در مسیر بیوسنتز و انتقال پیام اتیلن میباشد
22) و .(56 با این حال تقریباً تداخل عمل اجزاي پاییندست مسیر انتقال پیام گلوکز ناشناخته میباشد.
کاربرد خارجی قندها به طور قابل توجهی فرآیند پیري را در گلهایی که فرآیند پیري در آنها حساس به اتیلن است، کند میکند و به تأخیر میاندازد 44) و .(45 در گل میخک، تغذیه گیاه با قند اثر کاربرد اتیلن خارجی را کاهش داد
.(28) بخشی از چنین تأثیراتی احتمالاً ناشی از مهار سنتز اتیلن در گلبرگها به دنبال تیمار با قندها میباشد. در گلهاي میخک، ساکارز افزایش فراوانی mRNA تقریباً تمام ژنهاي مرتبط با پیري را با تأخیر همراه ساخت. حداقل بخشی از اثر قند علاوه بر مهار ژنهاي بیوسنتزي میتواند از طریق کاهش فراوانی mRNA ژن eil3 و پروتئین مرتبط با آن توجیه شود .(21) همچنین بررسیها نشان داده که وجود مقادیر بالاي قند میتواند تجزیه فاکتورهاي رونویسی ein3
را در پروتئوزومها تشدید کند .(54) علاوه بر ساکارز و گلوکز، سایر قندها نظیر ترهالوز، مانیتول و انیوزیتول نیز موجب تأخیر فرآیند پیري در برخی گونههاي گیاهی میشوند. مطالعات انجام شده روي لاله (24)، گلایول 4) و 33 و (53 تأثیر این نوع قندها را در تأخیر فرآیند پیري نشان داده است. کاربرد قندهاي خارجی روي فرآیند پیري گلهاي غیرحساس به اتیلن، با تأخیر در بیان ژنهاي درگیر در جا به جایی مجدد اسیدهاي چرب و پروتئین همراه میباشد .(13)
در این تحقیق سعی گردیده تا با مطالعه بیان ژن ein2 در گیاه، نقش و اهمیت ein2، و عوامل احتمالی مؤثر در کنترل چندگانه هورمونی یک فرآیند فیزیولوژیک نظیر پیري و تداخل مسیرهاي انتقال پیام آنها با اتیلن مورد بررسی قرار گیرد. البته نحوه بیان این ژن در بافتهاي زایشی و رویشی،
574
DNase I (RNase-
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 4، 1392
شناخت اثرات متقابل با عوامل مختلف و سازوکارهاي تنظیمی احتمالی در تصمیمگیري و طراحی راهبرد مناسب در مراحل بعدي این مطالعه تعیینکننده خواهد بود.
مواد و روشها
مواد گیاهی: بذور اطلسی (Petunia×hybrida) در شرایط استاندارد گلخانه، در دماي 24/16 درجه سانتی گراد (شب/روز) و دوره نوري 16/8 (تاریکی/نور) در جعبههاي پلاستیکی حاوي مخلوط 30 درصد پیت و پرلیت، 30
درصد ماسه و 40 درصد خاك غنی شده کشت داده شدند.
براي تعیین الگوي بیان و مقایسه مقادیر mRNA ژن ein2
در بخشهاي مختلف رویشی و زایشی گیاه نمونهبرداري از بافت برگ، ساقه، ریشه، بخش تحتانی گلبرگ، بخش فوقانی گلبرگ، پرچم، تخمدان، خامه/کلاله و کاسبرگ انجام شد.
گردهافشانی: گلهاي باز شده یک روز قبل از گردهافشانی اخته گردید و روز بعد کلاله به طور مصنوعی با انتقال گرده از پرچم گل گردهدهنده گردهافشانی شد. زمان گردهافشانی بهعنوان ساعت صفر نمونهبرداري براي مطالعه مقایسهاي تغییرات تجمعی mRNA ژن ein2 در بافتهاي گلبرگ و خامه/کلاله در گیاهان گردهافشانی شده و غیر گردهافشانی شده در نظر گرفته شد.
تیمار ACC :گلها یک روز قبل از گردهافشانی از گیاه جدا و بلافاصله بعد از انتقال به تیوبهاي حاوي 100 ) ACC
میکرو مولار)، در شرایط محیطی کنترل شده (دماي 25/18
درجه سانتی گراد (شب/روز) و (100ʽEm2s-1 نگهداري شدند. نمونهبرداري از بافت گلبرگ گیاهان تحت تیمار
ACC و شاهد در بازههاي زمانی 0، 2، 4، 6 و 24 ساعت بعد از تیمار با حداقل 2 تکرار (سه گل در هر تکرار) انجام شد. براي بررسی نقش مهارکنندگی AgNO3 از غلظت 50
میکرو مولار بهعنوان کنترل در این آزمون استفاده گردید.
تیمار گلوکز: در یک آزمایش جداگانه گلها در زمان گردهافشانی از گیاه جدا و بلافاصله به تیوبهاي 1/5 میلی لیتري حاوي آب مقطر یا گلوکز 5 درصد منتقل و در شرایط محیطی کنترل شده مشابه تیمارهاي فوق نگهداري شدند. آب مقطر و محلول گلوکز به صورت روزانه تعویض و محلول تازه در طول آزمایش جایگزین گردید.
نمونهبرداري از بافت گلبرگ گیاهان تحت تیمار گلوکز و گیاهان شاهد در بازههاي زمانی 0، 24، 48 و 96 ساعت بعد از تیمار انجام شد.
تیمار آبسیزیک اسید :(ABA) گلهاي اطلسی در مرحله گردهافشانی از گیاه جدا شده و بلافاصله تحت تیمار ABA
100) میکرو مولار) قرار گرفته و در بازههاي زمانی 0، 2، 4 و 6 ساعت بعد از تیمار، نمونهبرداري از بافت گلبرگ گیاهان تحت تیمار آبسیزیک اسید انجام شد.
استخراج RNA و آنالیز کمی بیان ژن : بهمنظور بررسی الگوي بیان ein2 بهعنوان یک فاکتور از مسیر MAP کینازي و نقش آن در فرآیند پیري، الگوي بیان ژن ein2 در بافتهاي رویشی و زایشی و تحت تیمارهاي مختلف به همراه ژنهاي مسیر بیوسنتزي acs2 و acs4 و فاکتور رونویسی
eil1 در پاییندست مسیر انتقال پیام اتیلن مورد آنالیز قرار گرفت. استخراج RNA از نمونههاي بافت برگ، ساقه، ریشه، کاسبرگ، گلبرگ (ناحیه فوقانی و تحتانی)، تخمدان، کلاله، میله پرچم، بساك در گیاه اطلسی با استفاده از کیت استخراج (RNeasy Plant Mini Kit QIAGEN) RNA
انجام شد. بهمنظور جلوگیري از تکثیر احتمالی DNA
ژنومی مرتبط با ein2 در واکنشهاي شبه کمی RT-PCR،
نمونههاي RNA استخراج شده با
Free)، در دماي 37 درجه سانتی گراد به مدت 30 دقیقه
تیمار شدند. مخلوط واکنش سپس با استفاده از فنل-
کلروفورم تخلیص و با اتانل مطلق رسوب داده شد. کمیت
RNA استخراج شده با استفاده از سنجش جذب نوري در طول موج 260 nm اندازهگیري و بهمنظور تعیین خلوص
575
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)
آن از الکتروفورز در ژل آگارز 1/2 درصد بافر TBE (0.5×) ولتاژ 100 ولت به مدت 20 دقیقه استفاده شد.
با استفاده از آنزیم نسخهبردار معکوس M-MuLV، رشته
cDNA در واکنشهاي 20 میکرولیتري با ترکیب 2
میکروگرم RNA کل نمونههاي گیاهی، 100 پیکومول
Oligo (dT)18، 2 میکرولیتر 10 dNTP mix میلی مولار
(غلظت نهایی 1 میلی مولار)، 0/5 میکرولیتر 20) واحد)
بازدارنده RNase، 200 واحد آنزیم M-MuLV و 4
میکرولیتر بافر واکنش (5×) و آب مقطر دیونیزه تا حجم
20 میکرولیتر ساخته شد. واکنشهاي PCR در دستگاه ترموسایکلر بیومترا مدل Personal، در حجم 25 میکرولیتر انجام شد. مقادیر موازنه شده از مخلوط واکنش ساخت رشته اول cDNA به هر واکنش PCR وارد شد. براي آنکه شدت باند تکثیر شده در هر واکنش PCR متناسب با مقدار الگوي وارد شده به واکنش باشد، این واکنشها قبل از پایان مرحله تصاعدي تکثیر خاتمه داده شدند. بهمنظور یافتن تعداد دوره مناسب براي تکثیر خطی، واکنشهاي PCR با توالی آغازگرهاي رفت و برگشت مورد
جلد 26، شماره 4، 1392
دورههاي 18، 21، 24، 27 و 30 در تمام آزمایشات انجام شد. افزایش خطی محصول PCR تا چرخه 27 در واکنشها مشاهده گردید. بنابراین در تمام آزمایشات از 27 دوره در برنامه PCR استفاده شد. از کنترل داخلی Ubi3 (مربوط به یوبیکوئیتین) در کمیسازي و مقایسات استفاده شد.
همچنین از نمونههاي RNA تیمار شده با DNaseI بهعنوان کنترل منفی در واکنشهاي PCR شبه کمی بهمنظور تأیید عدم آلودگی با DNA ژنومی استفاده گردید.
با استفاده از توالیهاي ثبت شده ژن ein2 در بانک ژن مربوط به آرابیدوپسیس (AtEIN2, AF141202)، برنج
(OsEIN2, AY396568)، ذرت (zmEIN2, AY359584)،
گوجهفرنگی (LeEIN2, AY566238)، یک جفت آغازگر رفت و برگشت 18 مري با استفاده از نرمافزار Primer Premier v.3.5 طراحی گردید. این جفت آغازگر یک قطعه 326 جفت بازي حدفاصل نواحی 2792 و 3117
انتهاي '5 ژن را تکثیر مینماید.
استفاده در این مطالعه براي ژنهاي
ein2 : 5`-ATTAGCAGGTCTTGGTCG-3` و 5`-GCTCCTTCGGGACTCTAT-3` ،
eil1 : 5`-AGGAAATGGGGTTCTGTG-3` و 5`-GGTAGGACCAACTGGATTAGA-3` ،
acs2 : 5`-TAACCCAAAAGCCTCCAT-3` و 5`-AAGACCGTAGCAGCATAAAT-3` ،
acs4 : 5`-CTACCGTATTCAATCCTCC-3` و 5`-AGTTTCCAAAGTGACATCTC-3` ،
5`-CAGCAGAAGGAAGGGAT-3` : ubi3 و 5`-ACCGCACTCAGCATTAG-3` میباشد.
دناتوراسیون در دماي 94 درجه سانتی گراد به مدت 2 بروماید 0/5 ʽg/ml رنگآمیزي شده و در دستگاه
دقیقه براي دوره اول و در دورههاي دوم به بعد به مدت 1 عکسبرداري از ژل مورد بررسی قرار گرفتند. کمی سازي
دقیقه، دماي مرحله اتصال آغازگر با توجه به نوع آغازگرها محصولات PCR به وسیله آنالیز دیجیتال تصاویر و
انتخاب شد و زمان اتصال در تمام چرخهها 1 دقیقه در نظر براساس شدت باندهاي تکثیر شده روي ژل آگارز با
گرفته شد، بسط در دماي 72 درجه سانتی گراد به مدت استفاده از نرمافزار (Total lab software Phoretix , 1.10)
75 ثانیه و در دوره آخر به مدت 10 دقیقه انجام شد. انجام شد.
محصولات واکنش PCR تکثیر اختصاصی قطعات DNA نتایج
مورد نظر را در ژل آگارز 1/2 درصد و بافر TBE 0/5×، با
مقایسه بیان ژن ein2 در بافتهاي مختلف اطلسی: مقایسه
ولتاژ 75 ولت به مدت 45 دقیقه الکتروفورز گردید.
قطعات DNA تفکیک شده در ژل آگارز در محلول اتیدیوم بیان ژن ein2 با استفاده از روش RT-PCR شبه کمی در
576
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 4، 1392
بافتهاي زایشی و رویشی اطلسی حضور مقادیر مختلف
mRNA ژن ein2 را در سطوح مختلف در این بافتها تأیید نمود (شکل .(1 به طور کلی نتایج حکایت از تجمع بالاتر مقادیر این ژن در بافتهاي زایشی نسبت به بخشهاي رویشی نظیر برگ، ساقه و ریشه داشت. بررسی و مقایسه بیان ژن ein2 در بافتهاي مختلف گل نیز حکایت از سطوح بیان بالاتر mRNA ژن ein2 در ژینئوسیوم (شامل خامه، کلاله و تخمدان) نسبت به سایر بافتهاي گل اطلسی داشت.
در بین بافتهاي زایشی میزان تجمع نسخههاي mRNA ژن
ein2 در پرچم در مقایسه با سایر بافتهاي زایشی کمترین بیان را نشان داد (شکل .(1
شکل -1 مقایسه الگوي بیان ژن ein2 در بافتهاي رویشی و زایشی اطلسی در مرحله گردهافشانی (ردیف پایین نمایانگر باند حاصل از بیان ژن UBI3 بهعنوان شاهد و استفاده مساوي از mRNA ها در
RT-PCR است).
شکل -2 تغییر بیان ژنهاي ein2، eil1، acs2 و acs4 در بافت گلبرگ و خامه/کلاله 24 ساعت بعد از گردهافشانی
تغییر بیان ژن ein2 به صورت بافت-اختصاصی با عمل
گرده افشانی: در این بررسی نقش گرده افشانی بهعنوان یک عامل مهم در فرآیندهاي تکاملی و خصوصاً پیري بافت زایشی، در تغییر میزان بیان ژن ein2 مورد مطالعه قرار گرفت (شکل .(2 نتایج نشان داد که بیان ژن ein2 در بافت گلبرگ 24 ساعت بعد از گرده افشانی اختلاف قابل توجهی با گیاهان گرده افشانی نشده نشان نداد. با این حال، تغییرات بیان ژن ein2 در بافت خامه+کلاله کاملاً چشمگیر بود، بهطوريکه بعد از گرده افشانی میزان بیان ژن در خامه+کلاله کاهش پیدا کود (شکل .(2
