بخشی از مقاله
چکیده
باکتري Ralstonia solanacearumهیک باکتري خاکزي بوده و در گیاهان زیادي ایجاد بیماري می کند. بیشترین اثر باکتري روي سیستم آوندي گیاه میزبان می باشد و باعث ایجاد پژمردگی در گیاه می شود. جهت مدیریت بیماري در میزبانهاي مختلف می توان از کاربرد ارقام مقاوم، تناوب زراعی و بهداشت زراعی استفاده نمود. براي تشخیص این باکتري تستهاي متنوعی همانند مشاهدههتجمع ذرات پلی بتا هیدروکسی بوتیرات، احیايهنیترات و تولیدگازازآن، مصرف منابع کربنیهو غیره وجود دارد که در این مقاله این روشها معرفی شده اند.
.1 تجمع ذرات پلی بتا هیدروکسی بوتیرات
پلی بتا هیدروکسی بوتیرات یک نوع استر پلی مري است که به عنوان یک منبع انرژي به کار می رود.این ماده همچنین به عنوان یک ماده ي تشخیصی براي این باکتري کاربرد داردزخطههدو محیط کشت معمولی جهت افزایش تجمع این مواد استفاده می شود.ه1بهمحیط آگار مغذي که با لهدرصد سوکروز غنی شده است. خبهمواد محیط معدنی در جدول1آمده است.مقدار لهگرم بر لیتر، بتا هیدروکسی بوتیرات به آن اضافه شده وpHهآن به خفچهمی رسد.باکتریها به مدت چخهتا سچه ساعت قبل از انجام آزمون، کشت می شوند.آزمون با یکی از این سه روش زیر دنبال می شود:هه
پس از این که بیشتر رنگ حل شد، محلول را تکان داده و اجازه می دهیم که به مدت یک شب قبل ازهاستفاده باقی بماند.این محلول در دماي اتاق تا چندین ماه قابل نگهداري می باشد.در مرحله بعدي باکتري را بر روي لام شیشه اي پخش نموده و با جریان هوا ویا حرارت آن را خشک و ثابت می کنیم. سپس سطح لام را با محلول ذکر شده غرقاب نموده وبه مدت ه1هتا ل1هدقیقه باقی می گذاریم.محلول اضافی را خشک نموده و سطح لام را با زایلن تمیز می کنیم. پس از آن سطح لام را با محلول لفههدرصد آبی سافرانین به مدت لهتا ه1هثانیه غرقاب نموده وبلافاصله زیر شیر آب شسته وپس از خشک نمودن با گوشه ي دستمال کاغذي لام را در زیر میکروسکوپ نوري مشاهده میهکنیم.این ذرات داراي رنگ آبی تیره اي هستند. این ذرات در میکروسکوپ الکترونی نیز به صورت اجسام تخم مرغی شکل قابل مشاهده اند. با این روش نمی توان به آسانی اندوسپور را از تجمع این ذرات تفکیک کرد، بنابر این قبل از استفاده باید از این که باکتري فاقد اسپور باشد، اطمینان حاصل کنیم.
روش ببهدر این روش از محلول یک درصد رنگ Nile blue Aههبراي رنگ آمیزي این ذرات استفاده می شود.براي تهیه ي این رنگ نیز بهتر است براي حل شدن آن محلول را گرم نموده وسپس فیلتر کنیم. باکتري ثابت شده در سطح لام را با این رنگ غرقاب نموده و به مدت ه1هدقیقه در دماي للهدرجه سانتی گراد نگه می داریم، سپس لام را به طور جزئی با آب شیر شستشو داده وبا استفاده از اسید استیک سهدرصد اقدام به رنگبري رنگ باقیمانده در زمان یک دقیقه می نماییم. پس از این مرحله لام را زیر شیر آب شسته وسپس در زیر میکروسکوپ نوري مشاهده می نماییم. براي مشاهده تجمع این ذرات از میکروسکوپ فلورسنت نیز می توانیم استفاده کنیم که تجمع این ذرات داراي رنگ پرتغالی روشن فلورسنت می باشند.
روش پ: ردیابی توسط نور ماوراي بنفش با کاربرد محیط کشت NB این ذرات به وسیله ي تعداد زیادي از باکتري هاي گرم منفی وهوازي تولید می شود .رنگ پرگنه هاي داراي این ذرات پرتغالی روشن فلورسنت تا زرد تحت نور ماوراي بنفش با طول موج کککهنانومتر می باشد البته این پرگنه ها باید روي محیط کشت حاوي هیدروکسی بوتیرات ورنگ Nil Blueهباشد.پرگنه سودوموناس هاي فلورسنت روي این محیط فلور سنت نبوده وذرات فلورسنت قابل مشاهده نیستند. مواد این محیط در جدول خآمده است.هpH این محیط در حدود چهمی باشد .پس از اتوکلاو نمودن محیط وسردشدن آن، میزان هه1میلی لیتر از محلول گلوکز هخهدرصد فیلتریا اتوکلاو شده در دماي پایین تر رابه آن اضافه می کنیم. دقت شود اتوکلاو گلوکز از ل1هدقیقه بیشتر نشود، چون روي برخی ازسودوموناس هاي غیرفلورسنت موثر می باشد.
.2 احیاي نیترات و تولیدگازازآن
بیش از هشهدرصد ازجدا یه هاي باکتري R. solanacearumهدربیووار هاي ک، چهولهازنیترات گاز تولید می نمایند، در حالی که که این توانایی دربیوارهاي 1هوخهمحدود می باشد. تقریبا تمام جدایه هاي باکتري به صورت غیرهوازي درحضور نیترات رشد نمایند. این جدایه ها نیترات رابه نیتریت تبدیل می کنند. جدایه هاي فاقد این توانایی اکثرا متعلق به بیوارخهمی باشند. براي این آزمون انتخاب محیط کشت معیار مهمی می باشد، چراکه دربرخی ازمحیط کشت ها تولید گازازنیترات امکان پذیر نمی باشد. از این رو نتایج مطمئن بااستفاده ازمحیط کشت van den Mooterه - جدول ک - به دست می آید pHهمحیط درحدود شفکهتنظیم می شود. محیط راجوشانده تا آگارذوب شودو سپس چبکهمیلی لیتر رادرلوله هاي کشت تقسیم می کنیم . لوله ها رابه مدت هکبهخهدقیقه دردماي 1خ1هدرجه سانتیگراد اتوکلاو می کنیم وسپس لوله هادردماي اتاق یا در یخچال نگهداري می شوند.
براي تلقیح با استفاده از یک میله شیشه اي مقداري ازپرگنه راازروي ظرف محیط کشت برداشته ودرداخل لوله ها تلقیح می کنیم . سپس سطح لوله هاراباکبخهمیلی لیترمحلول آب آگار کهدرصد ذوب شده می پوشانیم . این لوله هادردماي سخهتا خکهدرجه سانتی گراد نگهداري شده و باید به طور روزانه بررسی شوند. درصورت تولید گاز حباب هاي گازدرداخل محیط کشت ویا زیر پوشش آگار قابل مشاهده می باشد. گاهی اوقات این واکنش ضعیف بوده، براي ایجاد واکنش قوي ترباید باکتري را چند بار درمحیط کشت حاوي نیترات تجدید کشت1هکنیم. جواب مثبت کاذب نیز درصورتی که محیط کشت دردماي چهدرجه سانتی گراد نگهداري شودممکن است به وجودآید زیرا حباب ایجاد می کند.
براي جلوگیري از این مشکل بایدمحیط را قبل ازاستفاده ذوب نماییم. این آزمون را به طریق دیگرنیز می توان انجام داد که پس ازتلقیح روي لوله ها را نمی پوشانیم وآنها را اینکوبه می کنیم. پس ازچبکهروز لوله هاي فاقدپوشش رابراي حضورنیتریت آزمایش می کنیم. براي انجام این آزمایش نیاز به محلول یدید نشاسته و اسید هیدروکلریدریک رقیق شده داریم. این مواد به شرح زیر طبق روش Skermanهبه دست می آیند - چطههه هفخهگرم کلریدروي را در ه1همیلی لیتر آب مقطر حل نموده،آن را جوشانده و مقدارچفههگرم نشاسته را در حالی که هنوز داغ است به آن اضافه می کنیم، پس از آن محلول را تا حجمهه1همیلی لیتر با آب مقطر رقیق نموده و پس از گذشت یک هفته آن را فیلتر می کنیم. قبل از استفاده از آن یک حجم بطور مساوي از محلول خفههدرصد یدید پتاسیم به آن اضافه
