بخشی از مقاله
خلاصه:
گوشت طیوربه عنوان یکی از مهمترین عوامل انتقال عفونت سالمونلائی در انسان شناخته شده است. آب مورد استفاده در قسمت پرکنی، پیش سردکن و سردکن - چیلر - در پروسه کشتار طیور میتواند موجب انتقال متقابل باکتريها گردد.
در این بررسی تعداد 52 نمونه، از آب منبع، آب پیش سردکن و چیلر کشتارگاه صنعتی طیور مشهد در ساعتهاي متوالی کاري باچهار تکراربرداشت گردید و بااستفاده از روش کشت مرسوم تعداد 10 نمونه آلوده به جنس سالمونلا تشخیص داده شد. کلنی هاي جداسازي شده به روش مولتی پلکس PCR با استفاده از سه جفت پرایمر - invA,fliC,Prot6E - که به ترتیب اختصاصی جنس سالمونلا،گونه تایفی موریوم و گونه انتریتیدیس می باشند مورد آنالیز قرارگرفت، %19/2 آلودگی به جنس سالمونلا، %1/9 به سالمونلا تایفی موریوم و%5/8 به سالمونلا انتریتیدیس مشخص گردید. با توجه به حضور گونه هاي بیماریزا در آب مورد استفاده در خط کشتار، رعایت اصول بهداشتی و استفاده از مواد ضدعفونی کننده مجاز ونیز استفاده از جریان متقابل آب و لاشه در چیلر توصیه می گردد.
مقدمه:
طیوري که به کشتارگاه ارسال می گردند می توانند حامل باکتري هاي پاتوژن و غیر پاتوژن در سطح پوست و پرها و نیز در محتویات روده ها باشند. این باکتریها می توانند طی مراحل مختلف فرایند تولید گوشت طیور به سایر لاشهها منتقل شوند - . - 2 آب مورد استفاده در قسمت پرکنی، پیش سردکن و سردکن - چیلر - در پروسه کشتار طیور می تواند موجب انتقال متقابل باکتري ها گردد، لذا آب مورد استفاده در این قسمتها به عنوان یکی از عوامل انتقال باکتري ها بین لاشه هاي طیور حائز اهمیت است
گونه هاي مختلف جنس سالمونلا به عنوان یکی از مهمترین پاتوژنهاي غذائی در جهان محسوب می گردند . طیور منشاء اصلی انتقال آلودگی به انسان شناخته شده است .سالمونلا انتریکا سرووارهاي انتریتیدیس و تایفی موریوم عامل بروز اغلب موارد شیوع سالمونلوز در انسان می باشند
هدف از انجام این مطالعه تعیین آلودگی آب مورد استفاده درسیستم خنک کننده لاشه طیور به باکتریهاي جنس سالمونلا در کشتارگاه صنعتی شهرستان مشهد با استفاده از روش کشت استاندار و تایید نشخیص و همچنین تعیین درصد حضور گونه هاي انتریتیدیس و تایفی موریوم به روش Multiplex-PCR با استفاده از پرایمر هاي اختصاصی جنس سالمونلا و هر یک از گونه هاي مورد مطالعه بود.
مواد و روش کار:
نمونه گیري: در کشتارگاههاي صنعتی طیور مشهد آب پیش سردکن هر دوساعت یکبار و آب سردکن - چیلر - هر پنج ساعت یکبار تعویض می گردد. در این بررسی تعداد 52 نمونه، از آب منبع، آب پیش سردکن و چیلر کشتارگاه صنعتی طیور مشهد باچهار تکرار به میزان 50 میلی لیتر بوسیله سرنگ استریل نمونهبرداري گردید. با توجه به زمان تخلیه آب در هر قسمت، از آب منبع، از آب قسمت پیش سردکن در دو مرحله - انتهاي ساعت اول و انتهاي ساعت دوم پس از شروع کشتار - . از آب چیلر در پنج مرحله - انتهاي ساعات اول، دوم، سوم، چهارم و پنجم پس از شروع کشتار - و در هر مرحله از دو قسمت ابتدا و انتهاي آن نمونهبرداري گردید. نمونه ها در شرایط استریل و در مجاورت یخ به آزمایشگاه ارسال گردید.
روش کشت مرسوم جهت تعیین حضور سالمونلا: پس از کشت در محیط پیش غنی کننده لاکتوز براث و محیط غنی کننده تتراتیونات و محیط انتخابیBG agar و سپس محیطهاي تفریقی TSI agar وLI agar و اوره، حضور باکتري سالمونلا مورد تایید قرار گرفت.
آزمایش مولتی پلکس:PCR از کلنی هائی که در روش کشت مرسوم به عنوان باکتري سالمونلا مورد شناسائی قرار گرفته بود، با استفاده ازکیت DNA - Diatom DNA Prep 100 - استخراج گردید و به عنوان تمپلیت در آزمایش PCR مورد استفاده قرار گرفت. مشخصات پرایمرهاي مورد استفاده و شرایط دستگاه ترموسایکلر در جدول 1 آمده است.
پرایمرهائی که ژن invA را مورد هدف قرار می دهد اختصاصی جنس سالمونلا و پرایمر هائی که ژنهاي fliC و Prot6E را مورد هدف قرار می دهند به ترتیب اختصاصی سرووار هاي تایفی موریوم و انتریتیدیس می باشند. نمونه کنترل مثبت سالمونلا تایفی موریوم و انتریتیدیس از مرکزتحقیقات و سرم سازي رازي تهیه گردید.
نتایج و بحث:
در روش کشت مرسوم از تعداد 10 نمونه باکتر سالمونلا جداسازي گردید. در آزمایش مولتی پلکسPCR نمونه هائی که در روش کشت مرسوم به عنوان سالمونلا مورد شناسائی قرار گرفته بود مورد تایید قرار گرفت که از این تعداد، 3 نمونه به عنوان سالمونلا انتریتیدیس و یک نمونه به عنوان سالمونلا تایفی موریوم مورد شناسائی قرار گرفت
جدول:1 مشخصات پرایمر های مورد استفاده جهت تشخیص جنس سالمونلا و سرووارهای تایفی موریوم و انتریتیدیس
شرایط ترموسایکلر: 95 درجه 5دقیقه، تعداد 35 سیکل شامل94درجه60 ثانیه،56درجه 30ثانیه،72درجه 30ثانیه و در انتها 72درجه 10 دقیقه
شکل :1 نتایج آزمایش مولتی پلکسPCR بااستفده از 3 جفت پرایمر: باند 284bp از ژن invA اختصاصی جنس سالمونلا، باند 559bp از ژن fliC اختصاصی گونه تایفی موریوم، باند180bp از ژن Prot6E اختصاصی گونه انتریتیدیس. ستون :1 مارکر-100bp ستون2 :کنترل سالمونلا تایفی موریوم- ستون:3 کننرل سالمونلا انتریتیدیس- ستون5،4؛7 نمونه مثبت سالمونلااتریتیدیس- ستون 6 نمونه مثبت تایفی موریوم- ستون : 8 جنس سالمونلا- ستون:9کنترل منفی چیلرها که به منظور سرد کردن و کاهش بار آلودگی لاشهها طراحی شدهاند، گاهی نه تنها باعث حذف یا کاهش آلودگی لاشه ها به سالمونلا نمیشوند، بلکه خود به عنوان مکانی جهت انتقال متقابل این باکتري بین لاشه ها عمل میکنند
در این مطالعه %19/2 از نمونه ها آلوده به جنس سالمونلا تشخیص داده شد، که از این تعداد %30 به عنوان سالمونلا انتریتیدیس و %10 به عنوان سالمونلا تایفی موریوم و %60 نیز به عنوان سایر گونه هاي سالمونلا تشخیص داده شد. مطالعات در کشورهاي مختلف حضور سالمونلا در لاشه هاي طیور را %3 تا %66 گزاذش نموده اند و گونه غالب در اغلب کشورها سالمونلا انتریتیدیس بوده است
تفاوت در تخمین میزان حضور سالمونلا، ممکن است تا حدودي مربوط به کاربرد روشهاي مختلف جداسازي باشد..
روش کشت مرسوم در مقایسه با روش PCR در تشخیص جنس سالمونلا از حساسیت کمتري برخوردار می باشد و مستلزم صرف وقت بیشتري می باشد.بعلاوه روش مرسوم قادر به تشخیص کلنی هاي خشن سالمونلا نمی باشد و با استفاده از این روش نمی توان سرووارهاي مختلف سالمونلا را تشخیص داد
در سال 2003 طی یک پروژه تحقیقاتی بین المللی جهت استاندارد نمودن تست PCR در تشخیص پاتوژنهاي مهم، مناسبترین ژن هدف جهت تشخیص جنس سالمونلا ژن invA معرفی گردید، که داراي حساسیت %99/6 و ویژگی %100 می باشد . در بررسی حاضر از این ژن جهت تشخیص جنس سالمونلا استفاده گردید. ژن fliC کد کننده فاز 1 فلاژلین می باشد
در یک مطالعه با استفاده از تست PCR در تشخیص جنس سالمونلا و گونه تایفی موریوم با استفاده از ژنهايinvA و fliC حساسیت این روش %95 و ویژگی آن %96/2گزارش گردید
ژن Prot6e یک ژن پلاسمیدي است که اختصاصا کد کننده فیمبریه سطحی در سالمونلا انتریتیدیس می باشد و استفاده از این ژن به عنوان هدف در تشخیص این گونه سالمونلا داراي حساسیت %95 و ویژگی %100 می باشد
در این مطالعه جهت تشخیص دو گونه تایفی موریوم و انتریتیدیس به ترتیب از ژنهايfliC و Prot6e به عنوان هدف استفاده گردید. با توجه به حضور گونه هاي بیماریزاي باکتري سالمونلا در آب چیلر و امکان انتقال آن به لاشه ها، رعایت اصول بهداشتی، استفاده از ضدعفونی کننده هاي مجاز در آب چیلر جهت کاهش آلودگی لاشه ها و نیز سرعت جریان آب متقابل حرکت لاشه توصیه می گردد.
