بخشی از مقاله
چکیده
سالمونلا یک میکرو ارگانیسم بیماری زا است که سبب بروز علایم معمولی تا حاد می گردد. این باکتری اجرام میله ای کوتاه، گرم منفی فاقد کپسول و اکثرا فاقد تاژک می باشد. تمامی سروتیپ های سالمونلا برای انسان پاتوژن محسوب می شود که از طریق حیوان به حیوان، حیوان به انسان قابل انتقال می باشد. سالمونلوز یکی از مهم ترین بیماری های مشترک بین انسان و دام می باشد که غذاهایی از قبیل گوشت و شیر خام و فراورده هایی که تحت تیمار حرارتی قرار نمی گیرند مهم ترین منبع آلودگی انسان با سالمونلا می باشد.
این مطالعه با هدف تعیین شیوع سالمونلا و سالمونلا انتریتیدیس و سالمونلا تیفی موریوم جدا شده از گوشت مرغ در اصفهان انجام شده است. در فاصله زمانی مهر1390 تا مهر ماه سال1391، از مناطق مختلف استان اصفهان 240 نمونه گوشت مرغ به طور تصادفی جمع آوری گردید. تمامی نمونهها از نظر وجود سالمونلا به روش استاندارد مورد آزمایش قرار گرفتند. به منظور استخراج DNA از باکتری های مورد مطالعه از روش جوشاندن - Boiling - استفاده شد.
مقدمه:
سالمونلا متعلق به خانواده Enterobacteriaceae می باشد. سالمونلا دارای گسترش جغرافیایی وسیعی است و قادر به ایجاد عفونت در طیف وسیعی از موجودات زنده از جمله انسان و حیوانات می باشد. سالمونلوز یکی از مهم ترین بیماری های مشترک بین انسان و دام است که هر ساله تلفات قابل توجهی در مرغ داری ها ایجاد می کنند که با رعایت بهداشت مواد غذایی و کنترل بیش تر بر فرایند کشتار دام و طیور می توان تا حدی از ایجاد این بیماری جلوگیری کرد.
- 4 - یکی از سروتیپ مهم سالمونلا انتریتیدیس می باشد که باعث مسمومیت غذایی در انسان می گردد و عوارضی که در فرد ایجاد می کند شامل سپتی سمی که با آزاد شدن آندوتوکسین از دیواره باکتری ارتباط دارد - 3 - و تظاهرات سپتی سمی ثانویه شامل مننژیت نخاعی می باشد که به وسیله سموم LT و ST سبب بیماری در فرد می گردد. منبع اصلی آلودگی مرغ و تخم مرغ می باشد . - 6 - میزان آلودگی سالمونلا در نمونه های مورد مطالعه ما 5/41در صد بود. Hernadez در سال 2005 طی تحقیقی که بر روی گوشت مرغ های یخ زده وارداتی انجام داد میزان آلودگی به سالمونلا 16/5 بیان گردید که بیش از نمونه های ما ارزیابی گردیده که با مطالعات ما همخوانی نداشت و اختلاف معناداری دارا بود . - 10 -
در مطالعاتی که توسط Hassan و همکاران در سال 2011 درکشور ایالت متحده انجام گرفت میزان آلودگی به سالمونلا تیفی موریوم 20 درصد در گوشت گاو چرخ شده، 36 درصد پای مرغ منجمد شده،52 درصد فیله مرغ منجمد شده ارزیابی گردید . - 9 - هدف ما از این تحقیق بررسی وضعیت آلودگی گوشت مرغ به باکتری سالمونلا تیفی موریوم و سالمونلا انتریتیدیس و همچنین مقایسه شیوع فصلی آلودگی انواع گوشت طیور به سالمونلا تیفی موریوم و انتریتیدیس بود.
مواد و روش ها:
تعداد 240 نمونه گوشت مرغ طی مهرماه 90 تا مهرماه 91 را از استان اصفهان به طور تصادفی جمع آوری گردید و در ظروف استریل و در کنار یخ به آزمایشگاه انتقال داده شد که ابتدا نمونه را به محیط پیش غنی سازی آب پپتونه انتقال داده شد و به مدت 24 ساعت در گرمخانه در دمای 37 درجه سانتی گراد قرار داده شد سپس نمونه ها را به محیط سلنیت سیستین منتقل و24 ساعت در دمای 43 درجه سانتی گراد قرار داده شد، سپس آن را در محیط سالمونلا-شیگلا آگار به صورت خطی کشت داده شد. پرگنه های بی رنگ با مرکز سیاه به عنوان پرگنه های مشکوک جهت تست های تکمیلی انتخاب شد.
گونه های سالمونلا جدا شده در آزمایش های باکتریولو ژی به روش PCR نیز آزمایش شدند. به منظور استخراج DNA از باکتری های مورد مطالعه از روش جوشاندن - Boiling - استفاده شد. برای این منظور 100 میکرولیتر از کشت یک شبه باکتری در محیط مایع آب پپتونه با 500 میکرولیتر آب مقطر به مدت 10 دقیقه جوشانده شد و به عنوان منبع DNA استفاده شد. جهت ردیابی ژن های مورد مطالعه شامل 23Rrna - جهت تشخیص جنس سالمونلا - ، ژن typh - جهت تشخیص گونه سالمونلا تیفی موریوم - ، ژن ent - جهت تشخیص گونه سالمونلا انتریتیدیس - توسط EmaddiChashni و همکاران - 2009 - استفاده گردید. برای انجام آزمایش PCR از دستگاه Master cycle gradient - Eppendorf - استفاده شد.
PCR از لحاظ حجمی شامل 50 میکرولیتر که تشکیل شده از:
5 میکرولیتر PCR buffer 10x، 3 میکرولیتر 50 Mm Mgcl2 ، 2/5 میکرولیتر . dNTP Mix 10 mm
3 میکرولیتر از زوج پرایمر های F و R، 5 میکرولیتر از DNA مربوط هر نمونه و 1 واحد آنزیمTaq DNA Polymerase
در هر مرحله از آزمایش PCR جهت ردیابی محصول مورد نظر از ژل یک درصد آگاروز استفاده شد برای این منظور یک گرم پودر آگاروز در 100 میلی لیتر بافر 1X - Tris-Boric Acid-EDTA - TBE T ذوب و بعد از اضافه کردن 5 میکرولیتر رنگ اتیدیوم بروماید به آن در سینی مخصوص الکتروفورز ریخته شد. جهت انجام الکتروفورز 15 میکرولیتر از محصول PCR با سه میکرولیتر رنگ نشانگر - - Loading Buffer مخلوط و در چاهک ژل منتقل گردید.
رنگ نشانگر از ترکیب رنگ برومو فنل بلو و یک ماده غلیظ و چسبنده مثل گلیسرول یا سوکروز تشکیل شده که ویسکوزیته نمونه با این بافر افزایش یافته و انتقال آن به داخل چاهک ژل تسهیل می گردد. مولکول های DNA به دلیل داشتن فسفات که دارای بار منفی است، به سمت قطب مثبت حرکت می کند. به همراه نمونه از مارکر DNA جهت تعیین اندازه باند مورد نظر در الکتروفورز استفاده شد. الکتروفورز نمونه ها در ولتاژ ثابت 90 ولت به مدت حدود 1 ساعت انجام گرفت. پس از انجام الکتروفورز با انتقال ژل به دستگاه قرائت کننده ژن - Gel Documentation - نتیجه مورد بررسی قرار گرفت. اتیدیوم بروماید با اتصال به DNA باعث مشاهده رنگ فلورسانس در زیر نور UV، در محلی که مولوکل های DNA قرار دارند می شود. در پایان با تهیه عکس از ژل و پبت آن روی کاغذ حساس به حرارت می توان به تفسیر نتایج پرداخت.
نتایج و بحث:
نتایج به دست آمده از مطالعه حاضر نشان داد سطوح خارجی لاشه بیش ترین میزان آلودگی را دارا هستند که مطالعات مشابه آن را تایید می کند. به طور کلی شیوع سالمونلا در نمونه های مورد مطالعه با روش 5/41PCR درصد به دست آمد. مطالعاتی هم توسط Mizaie و همکاران در سال 2009 بر روی گنجشک، Emaddi و همکاران در سال 2009 بر روی جوجه های خانگی ، Malorny و همکاران در سال 2007 بر روی گوشت تخم مرغ و مرغ به وسیله روش PCR برای جداسازی سالمونلا انجام گرفت 11 - ،7و. - 12 سعیدی اصل در سال 1372 طی بررسی هایی بر روی حضور انواع سالمونلا در لاشه های مرغ کشتارگاه اهواز انجام داد.
از 100 نمونه جگر آزمایش شده 25 - درصد - آلوده به سالمونلا بودند 2 درصد تیفی، 8 درصد پاراتیفی A، 2 درصد پاراتیفی C و 13 درصد سایرین و از 100 نمونه گوشت مرغ 19 - درصد - آلوده بودند 2درصد تیفی،10 درصد پاراتیفی A، 2 درصد پاراتیفی C و 5 درصد سایر سروتیپ های سالمونلا و از 100 نمونه پوست مرغ 32 درصد آلوده بودند 4 درصد تیفی، 18 درصد پاراتیفی A ، 6 درصد پاراتیفی C، 4 درصد سایر گونه ها می باشد . - 5 -
انیسیان در سال 1373 در تهران روی 120 نمونه لاشه مرغ آزمایش انجام داد که 68 عدد 56/6 - درصد - مثبت ارزیابی گردید سروتیپ های جدا شده از لاشه عبارت از تیفی موریوم 13/3 درصد،انتریتیدیس 11/6 درصد،تامسون 10/1 درصد،برندوپ 7/5 درصد،هاوانا 6/6 درصد،رستک 4/1،نیوپوت 1/6 و هایدلبرگ ./1 بود . - 1 - شاپوری و همکاران در سال 1388 بر روی 120 نمونه مرغ در شهر زنجان به صورت تصادفی نمونه جمع آوری کردند که 104 نمونه مثبت به سالمونلا ارزیابی گردید که فراوان ترین سروتیپ عبارت از S.gallinaru، S.agan،S.virchow، S.entritidis گزارش گردید.
- 2 - طی مطالعاتی که توسط Zweifel در سال 2003 از نمونه های جمع آوری شده از سکوم روی 653 گوسفند کشتار شده در دو کشتارگاه در سویس انجام داد 11 درصد نمونه ها آلوده به سالمونلا انتریکا بودند . - 15 - نتایج مطالعه که توسط Pennycott و همکاران در سالهای 1995 تا 2003 بر روی لاشه 779 پرنده وحشی صورت گرفت در بریتانیا انجام گرفت نشان داد که سالمونلا تیفی موریوم سروار غالب بود .
