بخشی از مقاله
چکیده
این مطالعه به منظور تکوین یک روش دقیق، سریع، ساده و کم هزینه، جهت جستجوي بقایاي داروي اکسی تتراسیکلین در شیر، به روشHPLC انجام گرفت. تعداد 80 نمونه شیر خام و پاستوریزه بدون استفاده از مراحل پیچیده استخراج و Clean up آماده سازي و از بابت بقایاي اکسی تتراسیکلین مورد ارزیابی قرار گرفتند. به منظور تعیین درصد بازیابی دارو از شیر غلظت هاي 0/1 ، 0/25 ، 0/5 ، 1 میکروگرم بر میلی لیتر مورد بررسی قرار گرفتند.
همچنین دقت روش با بررسی تغییرات درون روزي و برون روزي مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که محدوده آشکارسازي روش مورد استفاده در فاصله 0/08 -1 میکروگرم بر میلی لیتر می باشد. همچنین حداقل مقدار قابل اندازه گیري - LOQ - روش مورد بررسی 0/08 μg/ml و میزان LOD - حداقل مقدار قابل تشخیص - 0/05 μg/ml تعیین گردید. میانگین درصد بازیابی دارو از شیر بیشتر از %87/7 تعیین گردید.
نتایج حاصل از بررسی نمونه هاي شیر خام و پاستوریزه اخذ شده نیز نشان داد که از50 نمونه شیر خام تعداد 3 نمونه %6 و از30 نمونه شیر پاستوریزه تعداد 1 نمونه - %3/3 - داراي باقیمانده اکسی تتراسیکلین در دامنه غلظت 0/05 – 0/08 میکروگرم برمیلی لیتر بودند. غلظت این دارو در تمام نمونه هاي مورد بررسی کمتر از میزان حداکثر مجاز یعنی 0/1 μg/ml تعیین گردید . - P>0.05 - با توجه به اینکه کل زمان لازم جهت آنالیز هر نمونه با این روش کمتر از10دقیقه بوده و درصد بازیافت دارو از شیر نیز بسیار بالا می باشد می تواند به عنوان روش معمول و استاندارد جهت اندازه گیري این دارو در شیر مورد استفاده قرار کیرد.
کلمات کلیدي : اکسی تتراسیکلین، HPLC ، شیر
مقدمه
باقیمانده هاي مواد ضد میکروبی در شیر ممکن است سبب بروز واکنش هاي آلرژیک در افراد حساس، گسترش سویه هاي مقاوم باکتریها به آنتی بیوتیک و ایجاد مقاومت دارویی گردد. به همین دلیل به عنوان یک خطر جدي براي سلامت مصرف کننده محسوب می شود. از طرف دیگر حضور این ترکیبات در شیر می تواند سبب جلوگیري از فعالیت کشت آغازگر در تولید فرآورده هاي تخمیري شیر مثل پنیر شود از مشکلات سلامت انسان در نتیجه تتراسیکلین ها می توان اختلالات معدي روده اي ، رشد ضعیف جنین ، واکنش هاي ازدیاد حساسیت و دیگر اثرات توکسیک را نام برد.
از این رو بررسی و کنترل حضور
این ترکیبات در شیر از اهمیت بسزایی برخوردار می باشد. مطالعه حاضر با هدف یافتن روشی سریع، دقیق و با هزینه هاي اقتصادي کم به منظور تعیین مقدار باقیمانده اکسی تتراسیکلین در نمونه هاي شیر خام و پاستوریزه تولید و عرضه شده در منطقه مشهد به روش HPLC انجام گرفت.
مواد و روش کار
در این مطالعه، از اردیبهشت لغایت مرداد ماه، تعداد80 نمونه شیر خام تانک ذخیره از گاوداریهاي صنعتی اطراف مشهد، و 30 نمونه شیر پاستوریزه تولید و عرضه شده توسط کارخانجات شیر پاستوریزه استان خراسان جمع آوري گردید. نمونه ها در اسرع وقت در مجاورت یخ به آزمایشگاه منتقل گردید. پس از یکنواخت کردن نمونه ها از هر نمونه، 1 میلی لیتر برداشت شده و به 1/5 میلی لیتر محلول 20TCA درصد اضافه گردید.
سپس به مدت30 ثانیه با استفاده از Vortex مخلوط گردید. از مایع بی رنگ رویی با استفاده از سرنگ 2 میلی لیتري برداشت شده و با استفاده از فیلتر 0/45 میکرو متر صاف می گردید سپس در هر بار تزریق میزان 10 میکرولیتر از هر نمونه به دستگاه HPLC تزریق می شد. سایر مواد مورد نیاز از جمله داروي اکسی تتراسیکلین استاندارد، اسید استیک 1 درصد، استونیتریل، تري کلرو استیک اسید از شرکت Sigma تهیه گردیدند.
نتایج و بحث
نتایج حاصل از مطالعه حاضر نشان داد که محدوده آشکارسازي روش مورد استفاده در فاصله 0/08 -1 میکروگرم بر میلی لیتر می باشد در مقادیر کمتر از 0/08 μg/ml، روش از تکرارپذیري لازم برخوردار نمی باشد. به این معنی که در غلظت هاي پایین تر، درصدRSD مناسبی بدست نیامد. به همین دلیل می توان گفت حداقل مقدار قابل اندازه گیري در روش مورد مطالعه 0/08 μg/ml تعیین گردید. همچنین در مطالعه حاضر میزان LOD - حداقل مقدار قابل تشخیص - تعیین گردید.
درمطالعه اي که جهت تعیین بقایاي تتراسیکلین در میگو و شیر انجام دادند، LOQ را 50ng/gr و در مطالعه دیگري که Cinquina و همکاران به منظور تعیین مقدار اکسی تتراسیکلین در شیر بز انجام دادند، مقدار LOQ را 50μg/kg تعیین کردند در مطالعه اي که Boatto و همکاران به منظور تعیین مقدار اکسی تتراسیکلین در شیر میش انجام دادند، میزان LOQ ، 17/5 ng/ml تعیین گردید .مقایسه نتایج بدست آمده از این مطالعه با سایر مطالعات قبلی نشان داد که میزان LOQ روش مورد استفاده درمطالعه ما نسبت به دیگر مقالات بالاتر می باشد. دلیل این امر می تواند عدم استفاده از مراحل پیچیده استخراج و clean up و در نتیجه حضور ناخالصی ها در نمونه تزریق شده به دستگاه باشد.
محدوده بازیابی در این روش بین 80/7 تا 90/45 درصد قرار داشت که نشان دهنده بازیابی مناسب روش مورد مطالعه می باشد در مطالعه اي که جهت تعیین تتراسیکلین ها در شیر و بافت گاو انجام دادند، درصد بازیابی در3 غلظت 0/5، 1، 1/5 میکروگرم بر میلی لیتر را بیشتر از 81 درصد تعیین کردند . در این مطالعه درصد تغییرات درون روزي بین 1/1 تا 5 درصدودرصد تغییرات برون روزي بین 0/7 تا 5/5 می باشد که نشان دهنده
تکرارپذیري روش می باشد. مزیت روش مورد استفاده در این تحقیق این است که میزان اکسی تتراسیکلین در شیر بدون استفاده از مراحل پیچیده استخراج و clean up مثل هموژنیزاسیون نمونه با حلال استخراج، تبخیر محلول استخراج شده و استفاده از استخراج فاز جامد یا SPE و ... قابل اندازه گیري می باشد. در این مطالعه جهت استخراج دارو و رسوب پروتئین ها از محلول
20 TCA درصد که یک محلول اسیدي است، استفاده گردید که کل زمان لازم جهت آماده سازي هر نمونه کمتر از 3 دقیقه بود.
از طرفی آنالیز هر نمونه در حداکثر 7 دقیقه انجام شد. به همین دلیل به جرأت می توان گفت که این روش در مقایسه با دیگر روش هاي ارائه شده، یک روش سریع، ساده و کم هزینه می باشد که می توان آن را جهت اندازه گیري اکسی تتراسیکلین در شیر بخوبی مورد استفاده قرار داد. در مطالعه حاضر فاز متحرك حاوي استونیتریل، اسید استیک و آب به ترتیب به نسبت هاي 15، 5 ، 80 درصد حجمی بود.
در این مطالعه از50 نمونه شیرخام، تعداد3 نمونه - %6 - داراي اکسی تتراسیکلین با دامنه غلظت 0/05 – 0/08 میکروگرم در میلی لیتر بودند. همچنین از تعداد 30 نمونه شیر پاستوریزه، تنها در نمونه - %3/33 - داروي اکسی تتراسیکلین با غلظت 0/05 میکروگرم در میلی لیتر ردیابی شد. در کل از تعداد 80 نمونه شیر، تنها در 4 نمونه - %5 - داروي اکسی تتراسیکلین قابل ردیابی بود ولی در هیچکدام از 4 مورد، غلظت دارو به حداکثر مقدار مجاز آن - 0/1 μg/ml - نمی رسید.
لازم به توضیح است که محدوده آشکارسازي در روش مورد استفاده در این مطالعه 0/08 -1 میکروگرم بر میلی لیتر تعیین گردیده است و منحنی کالیبراسیون در این محدوده خطی می باشد. با این وجود در نمونه هایی که سطح زیر منحنی اکسی تتراسیکلین در آنها پایین تر از سطح زیر منحنی غلظت 0/08 μg/ml بدست آمده، با توجه به این که درصد بازیابی و دقت روش مورد مطالعه بسیار مناسب ارزیابی شده است، می توان فرض کرد که منحنی کالیبراسیون در غلظت هاي پایین نیز خطی می باشد.
به همین دلیل در نمونه هاي مورد مطالعه جهت تعیین غلظت از همین منحنی کالیبراسیون استفاده گردید. با توجه به سلامت انسان در دنیاي کنونی، پر واضح است که تعیین بقایاي تتراسیکلین ها از جمله اکسی تتراسیکلین در مواد غذایی مثل شیر، از اهمیت بسزایی برخوردار می باشد. همانطور که قبلا اشاره شد، روش مورد استفاده در این مطالعه یک روش سریع ، دقیق ، ساده و با هزینه هاي اقتصادي پایین می باشد که قادر به ردیابی مقادیر پایین تر از MRL جهت کنترل بقایاي اکسی تتراسیکلین در شیر و در نتیجه نظارت بر سلامت انسان می باشد .
