بخشی از مقاله
چکیده
سیتروباکتر فروندي از باکتریهاي گرم منفی بیماریزا در پرورش ماهی محسوب می شود که می تواند در شرایط محیطی از جمله تراکم زیاد، افزایش مواد آلی در آب و تغییرات درجه حرارت آب، ماهیها را مورد تهاجم قرار داده و با علائم سپتیسمی هموراژیک باعث تلفات ماهی هاي پرورشی شود. معمولا" در پیشگیري و درمان این بیماري از آنتی بیوتیک هاي وسیع الطیف استفاده می شود از جمله این آنتی بیوتیک ها تتراسیکلین ها هستند که به شکل استفاده در غذا مصرف می شود.
در تحقیق جاري به روش پی سی آر مقاومت ژنتیکی سیتروباکتر فروندي جدا شده از ماهیهاي بیمار و مقاوم به تتراسیکلین در آزمایش آنتی بیوگرام مورد بررسی و وجود ژنهاي مقاومت tet - O - , tet - M - , tet - B - , tet - A - tet - S - در این باکتریها بررسی شد. نتایج حاصل نشان داد باکتریهاي سیتروباکتر فروندي، داراي ژن tet - A - بودند. استفاده ناصحیح از آنتی بیوتیک هاي وسیع الطیف از جمله تتراسیکلین موجب توسعه این ژن در باکتریهاي بیماریزا از جمله سیتروباکتر فروندي شده است.
مقدمه
صنعت بزرگ آبزي پروري یکی از صنایع اقتصادي مهم کشور ایران میباشد، بطوریکه براساس سالنامه آماري سازمان شیلات ایران تولیدات آبزي پروري ایران در سال 1375 برابر با 65000 تن بوده که در سال 1390 به 285351 تن با رشدي برابر 4/4 برابر افزایش پیدا کرده است. با توجه به پدیدار شدن بیماریهاي نوظهور در صنعت آبزي پروري که سالانه تلفا ت زیادي را به این صنعت وارد می نماید، استفاده از آنتی بیوتیک ها براي درمان این بیماریها گسترش یافته که منجر به توسعه مقاومت به آنتی بیوتیک ها گردیده است. سیتروباکتر فروندي بعنوان یکی از عوامل باکتریایی بیماریزاي ماهی هاي آب شیرین می باشد
همچنین این باکتري عامل بیماریزا در ماهی آزاد آتلانتیک و ماهی قزل الاي رنگین کمان در اسپانیا و امریکا - 1 - و در ماهی کپور در هندوستان محسوب می شود . - 3 - بیماري سپتی سمی ناشی از این باکتري بیماریزا در زمره بیماریهاي نوظهور قلمداد می شود و جداسازي این باکتري از نقاط دیگر جهان نیز گزارش گردیده است.
ژنهاي مقاومت نسبت به تتراسیکلین نسبت به بقیه آنتی بیوتیکها از فراوانی و گستردگی بیشتري برخوردار است. بیشترین ژنهاي مقاومت رایج در باکتريهاي مقاوم به تتراسیکلین که تاکنون توسط محققین مختلف گزارش شده است، شامل ژن هاي - A/ B/ M/ O/S - می باشد . - 7 - از آنجا که در خصوص شناسایی ژنهاي مقاومت در صنعت آبزیان ایران مطالعه جامعی صورت نگرفته است، در این تحقیق سعی گردید تا با شناسایی الگوي ژنهاي مقاومت شایع تت آ به تتراسیکلین در باکتري سیتروباکتر فروندي بیماریزا در ماهی گستردگی مقاومت به آنتی بیوتیک هاي رایج از جمله تتراسیکلین را مورد بررسی قرار داد.
تتراسیکلینها علاوه بر درمان و کنترل عفونت در انسان، حیوانات و گیاهان، به عنوان افزودنی به غذاي حیوانات به مقدار کم در طولانی مدت براي تسریع رشد آنها استفاده میشود. در کشور آمریکا افزودن آنتی بیوتیک به جیره حیوانات براي تسریع رشد در حدود 200 گرم بر یک تن میباشد
مواد و روش کار
در این پژوهش جدایه هاي باکتریایی از جنس سیتروباکتر گونه فروندي جدا شده از ماهیهاي بیمار مزارع آکواریومی براي شناسایی ژن مقاومت تت آ شایع به آنتی بیوتیک تتراسایکلین به روش PCR مورد مطالعه قرار گرفت. نمونه هاي باکتریایی مورد مطالعه از دوازده جدایه موجود در بخش آبزیان بوده - نگهداري در دماي - -70c o که در طول چند سال اخیر از نمونههاي مختلف پرورشی و ماهیهاي آکواریومی سوروم داراي بیماري سپتی سمی جدا و به روشهاي بیوشیمیایی و مولکولی - PCR - تعیین گونه شده اند، مورد مطالعه قرا گرفتند.
روش جدا سازي باکتریها از ماهیهاي بیمار به این ترتیب بود که ابتدا از ماهی داراي علائم بیماري سپتی سمی هموراژیک از قسمت کلیه بر روي محیط Brain heart agar کشت داده و محیط کشت داده شده را در دماي 25 درجه سانتیگراد درون انکوباتور به مدت 48 ساعت گذاشته شد و از کلنیهاي بدست آمده کشت خالص تهیه گردید. علاوه بر تستهاي بیوشیمیایی براي شناسایی کلونی باکتري خالص شده همچنین از روش دقیق مولکولی PCR با استفاده از پرایمرهاي - universal - ، براي قسمت 16sریبوزوم باکتري مورد نظر مورد کاوش قرار گرفت. بعد از مشاهده وزن باند مورد نظر بر روي ژل الکتروفورزیس، محصولات PCR بدست آمده براي هر باکتري مورد نظر براي انجام سکانس نوکلئوتیدي ارسال شد. نتایج سکانس انجام شده در GenBank و سایت PubMed مقایسه و با استفاده از آن به گونه باکتري مورد مطالعه پی برده شد.
روش آنتی بیوگرام باکتریایی طبق پروتکل آزمایشگاهی میکروبیولوژي بطور دقیق صورت گرفت . - 6 - ابتدا به روش استریل باکتري مورد نظر را بر روي محیط کشت Mueller hinton agar به روش کشت خطی کشت داده، دیسک هاي آنتی بیوتیک استاندارد روي محیط قرار داده شد و محیط کشت درون انکوباتور با دماي 25 درجه سانتیگراد براي بدست آمدن قطر بازرندگی رشد باکتري قرار داده شد.
براي شناسایی ژن مقاومت در روش پی سی آر از پرایمر هاي اختصاصی استفاده شد. مشخصات مربوط به پرایمرهاي مورد استفاده براي شناسایی ژن مقاومت تت آ با استفاده از روش مینارد و همکاران - 4 - صورت گرفت.
کلیه پرایمرهاي نامبرده شده طی سفارش توسط شرکت سیناکلون - سیناژن - با جذب نوري حدود 15 الی20 سنتز شد. پس از رقیقسازي هر پرایمر طبق دستورالعمل شرکت سازنده، از هر پرایمر، محلولکاري با غلظت 10 میکرومولار، فراهم گردید.
نتایج
در بررسی مقاومت جدایه هاي سیتروباکتر فروندي مورد مطالعه در این تحقیق در روش آنتی بیوگرام بر روي پلیت، تعدادي از جدایه ها نسبتاً مقاوم بوده - intermediate resistance - و بیشتر جدایه ها در آزمایش آنتی بیوگرام کاملاً مقاوم - complete resistance - به تتراسیکلین بودند.
در نتایج بدست آمده از بررسی پنج ژن مقاومت به تتراسیکلین tet - O - , tet - M - , tet - B - , tet - A - tet - S - با استفاده از واکنش زنجیرهاي پلیمر از در باکتري سیتروباکتر فروندي مورد مطالعه مشخص گردید که این باکتریها حاوي ژن تت آ بودند
