بخشی از مقاله
خلاصه
بیوتیپ طبیعی شبه لیمو جیرفتی - . - Citrus sp اولین بار در سال 1385 در جیرفت مشاهده شد. تاکنون تحقیقی در خصوص خصوصیات مورفولوژیکی این ژنوتیپ و قرابت آن با سایر ارقام مرکبات انجام نشده است. این تحقیق با هدف مطالعه تجزیه روابط ژنتیکی بین شبهلیمو جیرفتی بعنوان یک بیوتیپ ناشناخته مرکبات با برخی ارقام استاندارد انجام گرفت.
براي این منظور علاوه بر بررسی خصوصیات موفولوژیکی و صفات ظاهري ژنوتیپ فوقالذکر، از نشانگر مولکولی ISSR جهت شناسایی و تعیین قرابت ژنتیکی آنها با سایر ارقام تجاري مرکبات استفاده شد. نتایج حاصل از ارزیابی خصوصیات مورفولوژیکی نشان داد که این بیوتیپ از نظر برخی خصوصیات از قبیل رنگ گل و طعم میوه با لمون لیسبون - C. limon - مشابه ولی از نظر شکل میوه متفاوت است.
در آزمون ISSR از تعداد 10 آغازگر براي تکثیر مکانهاي هدف در هیجده رقم تجاري استاندارد و ژنوتیپ شبه لیموجیرفتی استفاده شدتقریباً. همه آغازگرها چندشکلی بالایی نشان دادند.این نشانگر بخوبی قادر به تمایز ارقام مختلف مرکبات بود و توانست روابط خویشاوندي میان ارقام تجاري و ژنوتیپ مورد مطالعه را مشخص نماید. براین اساس شبه لیموجیرفتی با ضریب تشابه 0/76 بیشترین قرابت را به ژنوتیپ لمون لیسبون دارد. احتمال میرود که این دورگ جهشی از لیموها یا اینکه هیبریدي طبیعی از لمون لیسبون باشد.
مقدمه:
وسعت قابل توجه کشور ایران با اقلیمهاي مختلف، تنوع فراوان منابع ژنتیکی گیاهی، وجود خاصیت دگرگشنی در مرکبات و بوجود آمدن دورگهاي طبیعی با صفات مطلوب در این دورگها، ضرورت شناسایی و جمعآوري این دورگها و استفاده از آنها در تحقیقات مرکبات را بیش از پیش نمایان میکند . - 2 - با تلاش محققین و باغداران پیشرو تاکنون ارقام مختلفی از مرکبات که از طریق جهش، دورگگیريهاي طبیعی و تغییرات ژنتیکی حاصل شده اند شناسایی و معرفی شده اند که از جمله میتوان به دارابی، توسرخ، توسبز، لیمو گلابی آمل، شل محله، بکرایی و نظایر آنها اشاره کرد
اصلاح کنندگان سنتی گیاهان، ارقام را براساس نشانگرهاي مورفولوژیکی انتخاب و اصلاح کردهاند اما خصوصیات عمومی نشانگرهاي مورفولوژیکی چندان ایدهآل نیست. در سالهاي اخیر زیست شناسی مولکولی ابزارهاي مناسبی را جهت تجزیههاي جامع تر فراهم آورده است .
تعدادي از محقیقین از نشانگر مولکولی SSR و ISSR جهت بررسی تنوع ژنتیک و ارتباط فیلوژنتیک ارقام مختلف مرکبات استفاده کرده اند که از جمله می توان به تحقیقات گلعین - 34 و شهسوارو همکاران - 7 - اشاره کرد.
نتایج این تحقیقات نشان داده است که ISSR نشانگر قدرتمندي در متمایز نمودن گونههاي مرکبات داراي رابطه خویشاوندي بوده و قادر است روابط خویشاوندي میان ارقام تجاري و ژنوتیپهاي ناشناخته ژرم پلاسم مرکبات را مشخص نمایند.
مواد و روشها
بررسی صفات مورفولوژیکی: یادداشت برداري از صفات مورفولوژیکی شبه لیمو جیرفتی بر اساس توصیفنامه استاندارد بینالمللی مرکبات - 1999 - و از تعداد پنج درخت 4-5 ساله انجام گرفت.
استخراج DNA ژنومیک از نمونههاي گیاهی: استخراج DNA به روش موري و تامسون - 6 - از برگ هیجده رقم مختلف مرکبات بعلاوه بیوتیپ شبه لیمو جیرفتی انجام گرفت. فهرست ارقام مورد استفاده در شکل 1 آمده است.
واکنش زنجیرهاي پلیمراز و آزمون :ISSR براي بررسی چندشکلی قطعات DNA با استفاده از نشانگر ISSR از 10 آغازگر استفاده شد - جدول . - 1 واکنش زنجیرهاي پلیمراز با استفاده از دستگاه ترموسایکلر - Cleaver Sciences, GTX, Korea - حاوي 96 چاهک، و در حجم نهایی 15 میکرولیتر انجام شد. اجزاي واکنش شامل بافر 1X PCR، 1.5mM MgCl2، 0.2mM dNTPs، 1 واحد آنزیم Taq polymerase، 0.5µM آغازگر و 50 نانوگرم DNA بود.
چرخه حرارتی براي تکثیرDNA بصورت واسرشتهسازي اولیه در 94 درجه سانتیگراد بمدت 5 دقیقه، 40 چرخه شامل واسرشتهسازي در 94 درجه سانتیگراد بمدت 30 ثانیه، دماي اتصال براي هر آغازگر50 درجه سانتیگراد بمدت 45 ثانیه و توسعه در 72 درجه سانتیگراد بمدت 2 دقیقه و در نهایت 7 دقیقه توسعه نهایی انجام شد. به منظور بررسی و تفکیک محصولات حاصل از تکثیر، از ژل آگارز با غلظت 1/5 درصد استفاده شد.
آنالیز داده ها: جهت امتیازدهی باندها از نرم افزار Adobe photoshop استفاده شد. باندهاي چند شکل حاصل با روش صفر و یک امتیازدهی شدند. تعداد آلل موثر بر اساس روش کیمورا و کراو - 1964 - و تعداد آلل مشاهده شده و تنوع ژنی با استفاده از نرم افزارPOPGENE و بر اساس شاخص نی براي افراد محاسبه گردید. تنوع ژنوتیپی بر اساس شاخص اطلاعاتی شانون و با استفاده از نرم افزار POPGENE براي هر جمعیت برآورد شد.
تشابه و فاصله ژنتیکی، بر اساس روش نی - - 1972 و با در نظر گرفتن اریبی و بدون اریبی با استفاده از نرم افزار POPGENE محاسبه شد. در این تحقیق از سه روش نی و لی، جاکارد و تطابق ساده براي محاسبه ضرایب تشابه استفاده شد. براي محاسبه ضریب کوفنتیک از نرم افزارNTSYS-pc استفاده شد. تجزیه به مختصات اصلی و رسم نمودارهاي دو بعدي و سه بعدي، با استفاده از نرم افزار NTSYS-pc انجام شد. دسته بندي افراد با استفاده از تجزیه خوشهاي توسط نرم افزار NTSYS-pc صورت گرفت. تجزیه خوشهاي به روش UPGMA و ضریب تشابه تطابق ساده که داراي بیشترین مقدار ضریب همبستگی کوفنتیک بود، انجام شد . - 3 - دندروگرام در ضریب تشابه 0/68 برش داده شد.
جدول.1 اسامی و توالی نوکلئوتیدي آغازگرهاي مورد استفاده
نتایج و بحث
تقریباً همه آغازگرهامورد استفاده در این تحقیق چندشکلی بالایی نشان دادند. این آغازگرها قادر به تکثیر بیش از %90 مکانهاي هدف در هر ژنوم آزمون شده بودند. این امر بیانگر میزان بالاي حفظ توالی آغازگر بین ارقام آزمون شده میباشد. نتایج بدست آمده در خصوص بررسی استفاده از نشانگرهاي ISSR در تمایز ژنوتیپها مشخص مینماید که این نشانگر، قادر به تفکیک بین ژنوتیپهاي بسیار نزدیک نیز میباشد و میتوان با کمترین اشتباهی ژنوتیپ هر رقم را ارزیابی نمود.
آزمایشات مشابهی در این خصوص توسط محققان دیگر 7 - ، 4، - 5 گزارش شده است که نتایج تحقیق حاضر با گزارشات آنها مطابقت دارد . براساس دندروگرا بدست آمده، ژنوتیپهاي مورد بررسی در 5 گروه اصلی A - ، B، C، D و - E گروهبندي شدند - شکل. - 1 گروه A داراي سه زیرگروه است که با ضریب تشابه 0/74 از یکدیگر جدا شدهاند. زیرگروه اول شامل ژنوتیپ نارنج است. زیرگروه دوم شامل ژنوتیپهاي نارنگی - نارنگی محلی و نارنگی دانسی - که با ضریب تشابه 0/81 از یکدیگر جدا شدهاند.
زیرگروه سوم شامل پرتقال محلی، واشنگتن ناول و مارس ارلی است که با ضریب تشابه 0/86 از یکدیگر جدا شدهاند. پرتقال واشنگتن ناول و پرتقال مارس داراي ضریب تشابه 0/90 هستند. ژنوتیپهاي گریپ فروت دانکن، دارابی و یوزو نیز در این گروه قرار دارند. زیر گروه چهارم شامل لمون لیسبون و شبه لیمو جیرفتی است.
ژنوتیپ لمون لیسبون که با ضریب تشابه 0/76 از ژنوتیپ شبه لیموجیرفتی جدا شده بیشترین قرابت را در میان ژنوتیپهاي این گروه به شبه لیموجیرفتی دارد. گروه B شامل شدوك است که بهصورت جداگانه در یک گروه قرار گرفته است. گروه C شامل لیموشیرین، بکرایی، رافلمون و بالنگ است. گروه D شامل لیموترش محلی و مکزیکن لایم است که با ضریب تشابه 0/67 از یکدیگر جدا شدهاند. گروه E شامل ولکامریانا است که بهصورت جداگانه در یک گروه قرار گرفته است .
قرابت بیوتیپ طبیعی شبه لیموجیرفتی - رقم ناشناخته - با سایر ارقام مرکبات تاکنون تعیین نشده بود. خصوصیات مورفولوژیکی این بیوتیپ از قبیل رنگ گل و سطح پوست و طعم میوه با لیمو لیسبون - C. limon - مشابه ولی از نظر شکل میوه متفاوت است. نتایج حاصل از بررسی مولکولی با استفاده از نشانگر ISSR نشان داد که این بیوتیپ قرابت زیادي با لمون لیسبون دارد و به احتمال فراوان جهشی از لیموها یا اینکه هیبریدي باشد که یک طرف آن لمون لیسبون باشد. تکمیل آزمایشات مورفولوژیکی و مولکولی با سایر نشانگرها جهت شناسایی نشانگرهاي آگاهی بخش و تعیین تکمیلی قرابت ژنوتیپ مذکور پیشنهاد می گردد.
