بخشی از مقاله
چکیده
یکی از مهمترین و کاربردي ترین روش ها براي ایجاد مقاومت به ویروس ها استفاده از مکانیسم خاموشی ژن پس از رونویسی براي تخریب RNA ویروسی است. در این روش انتقال بخشی از ژن ویروسی با تشکیل dsRNA و ممانعت از بیان ژن موجب اختلال در چرخه ي زیستی ویروس در گیاه میزبان می شود. در این پژوهش از یک توالی موزاییک و حفاظت شده از ژن پوشش پروتئینی این ویروس - CP-P25 - کلون شده در وکتور خاموشی استفاده شد که به اگروباکتریوم سویه ي EHA105 ترانسفورم شده بود.
قطعات هیپوکوتیل و اپی کوتیل گیاهچه هاي نارنج رشد یافته در تاریکی، از طریق تکنیک هم کشتی با اگروباکتریوم، ترانسفورم شد. جوانه هاي حاصل از ریز نمونه هاي ترانسفورم شده مورد بررسی قرار گرفته و گیاهچه هاي مقاوم به علفکش بستا و ژنوتیپ هاي حاوي قطعه ي خارجی به عنوان تراریخته شناسایی شدند. گیاهچه هاي مذکور بر روي پایه هاي ریشه دار ریزپیوند شدند تا گیاه تراریخته ي کامل حاصل شود. این مطالعه به منظور بررسی کارایی ترانسفورماسیون با استفاده از اگروباکتریوم و بهینه سازي شرایط ترانسفورماسیون گیاه نارنج صورت گرفت.
کلمات کلیدي:ترانسفورماسیون، خاموشی ژن پس از رونویسی - - PTGS، اگروباکتریوم، هم کشتی
مقدمه
بیماري ویروسی تریستزا از جمله بیماریهاي بسیار مهم ویروسی است که از حیث اقتصادي خسارات بزرگی را درمناطق مختلف مرکبات خیز دنیا بوجود آورده است. متخصصین منشأ اولیه ویروس را آسیا می دانند . این ویروس اولین بار همراه با نهال هاي نارنگی انشو آلوده به ویروس در خلال سالهاي 1347 تا 1349 از ژاپن به ایران وارد شد اما، اکنون در حال کمون است و همیشه خطر طغیان آن وجود دارد.ایزوله از این ویروس از مناطق شمال و جنوب ایران جمع آوري شده که بر اساس توالی ژن پوشش پروتئینی دسته بندي و مجزا شده اند .
ترتیب و توالی ژنوم این ویروس کاملا شناخته شده است. ژنوم1CTV شامل 19,296 نوکلئوتید است که 17 محصول پروتئینی را کد می کند . ترانسفورماسیون ژنتیکی در گیاهان متکی بر دو فرایند مستقل و همزمان است: انتقال و تلفیق DNA خارجی به داخل سلول هاي گیاهی و سپس باززایی گیاه کامل از سلولهاي تراریخته انتقال ژن در مرکبات امروزه با روشهاي مختلف از جمله جذب مستقیم DNA ، انتقال بوسیله اگروباکتریوم و بمباران ذره اي انجام شده است که روش ترانسفورماسیون از طریق اگروباکتریوم یکی از کارآمدترین روشهاست بسیاري از گونه هاي مرکبات داراي راندمان انتقال ژن وهمچنین توان باززایی پایینی هستند و این از مهمترین محدودیت ها در اصلاح مرکبات با استفاده از روشهاي مولکولی است .
روش هاي مختلفی براي کنترل تریستزا وجود دارد که مهمترین آنها استفاده از روشهاي مهندسی ژنتیک و خاموشی ژن است واصطلاحا 2VIGS نامیده می شود .در مرکبات عموما قطعات اپی کوتیل و قطعات میانگره اي ساقه براي ترانسفورماسیون و باززایی گیاه مورد استفاده قرار می گیرند. سواي از مؤلفه ژنتیک گیاه ، زخم زدن اکسپلنت یا ریز نمونه ها و تیمار مناسب با فیتوهورمونها قابلیت پذیرش سلولها نسبت به اگروباکتریوم را افزایش می دهد.
کالوس هاي ترانسفورم شده را براي اولین بار بوسیله اگروباکتریوم تولید کردند . مور و همکاران موفق به تولید دو گیاهچه ي ترانس ژنی با استفاده ازبخش هاي میانگره گیاهان رشد یافته در روشنایی شدند . کانیوشی و همکاران تجربه مشابهی براي پونسیروس و پنا و همکاران براي نهال هاي رشد یافته در گلخانه گزارش کردند . گوتیرز و همکاران با استفاده از اگروباکتریوم موفق به درج ژن پوشش پروتئینی CTV در نارنج شدند.
بوند و رز انتقال ژن را به قطعات اپیکوتیل نهالهاي رشد یافته در تاریکی انجام دادند. آلمیدیا و همکاران نیز در 2003 ترانسفورماسیون بافت هاي میانگره اي مرکبات را بوسیله اگروباکتریوم انجام دادند .فاگوئاگا و همکاران در 2006 تلفیق و ترانس ژن پوشش پروتئین ویروس را در لیموي مکزیکی ثابت کردند . بتومن و همکاران در 2006 موفق شدند گیاه تراریخته مرکبات که ژن p23 ویروس تریستزاي مرکبات به آن منتقل شده بود تولید کنند .
مواد و روش ها
در این پژوهش از ژن CP-P25 پوشش پروتئینی CTV مربوط به نژادهاي مختلف ویروس استفاده شد که در قطب علمی ویروس شناسی دانشگاه شیراز ایزوله شده بود. این ژن به صورت دو توالی سنس و آنتی سنس تولید کننده ي dsRNA در ناقل خاموشی PFGC5941 داراي ژن 3nptII عامل ایجاد مقاومت به آنتی بیوتیک کانامایسین4 در باکتري و ژن bar عامل ایجاد مقاومت به علفکش غیر انتخابی آمونیوم گلوفوزینیت با نام تجاري بستا1 به عنوان شاخص انتخابی گیاهی درج و درE.coli کلون شده بود.
براي ترانسفورماسیون قطعات اپی کوتیل و هیپوکوتیل نارنج از سویه ي EHA105 اگروباکتریوم استفاده شد که ناقل مؤثري براي وارد کردن DNA خارجی به ژنوم مرکبات می باشد . وکتور کلون شده در E. coli استخراج و به دو روش الکتروپوریشن و ذوب و یخ به اگروباکتریوم انتقال یافت و صحت ترانسفورماسیون با انجام واکنش زنجیره اي پلیمراز - PCR - تأیید شد. بذور نارنج از میوه هاي تازه و سالم خارج شده و پس از جدا کردن پوسته خارجی ضد عفونی سطحی شد.
براي ضد عفونی بذرها در محلول 2% هیپوکلوریت سدیم به همراه 1 تا 2 قطره توئین 220 به مدت 15 دقیقه به آرامی تکان داده شده سپس3 مرتبه با آب استریل 45 تا 50 درجه سانتیگراد هر مرتبه به مدت 3 دقیقه شستشو شدند. در ادامه بذور به مدت یک دقیقه در اتانل 70 درصد و مجددا سه مرتبه در آب ولرم آبکشی گردیدند. بذرهاي ضد عفونی شده به محیط جوانه زنی منتقل و براي مدت 4 تا 6 هفته در 27 درجه ي سانتیگراد در تاریکی نگهداري شدند. پس از 4 تا 6 هفته قطعات هیپوکوتیل و اپی کوتیل به قطعات 1cm برش خورده و با باکتري تلقیح شدند.
در این تحقیق به منظور القاء ژن هاي بیماري زاي اگروباکتریوم از روش کشت سه روزه ي گلوین استفاده شد و علاوه بر این محلول استوسایرنگون به محیط تلقیح ریزنمونه ها افزوده شد. ریزنمونه ها در سوسپانسیون باکتري با OD600=1 به مدت 20 دقیقه غوطه ور و به آرامی تکان داده شده سپس با کاغذهاي صافی استریل خشک شدند. ریزنمونه هاي تلقیح شده به پتري هاي حاوي محیط هم کشتی منتقل شده و براي مدت 3 روز در تاریکی و در 27 درجه ي سانتیگراد قرار گرفتند.
سپس ریز نمونه ها به محیط کالوس زایی حاوي آنتی بیوتیک سفوتاکسیم5 منتقل و به مدت 7 روز در 27 درجه سانتیگراد و روشنایی 16 ساعته نگهداري شدند. در ادامه ریز نمونه ها به محیط انتخابی حاوي آنتی بیوتیک و علفکش مناسب و پس از 4 هفته به محیط ساقه زایی انتقال یافتند و هر 3 تا 4 هفته محیط کشت آنها تعویض شد. پس از استخراج DNA از جوانه هاي حاصل و انجام PCR گیاهان ترانسفورم شده بر روي پایه هاي کشت شده در محیط in vitro ریز پیوند شدند.
