بخشی از مقاله
بررسي تنوع ژنتيکي ارقام بادام با استفاده از نشانگر R A-seq SSR
خلاصه
در اين پژوهش تنوع و ارتباط ژنتيکي ١٩ رقم ايراني و خارجي بادام با استفاده از ١٢ جفت آغازگر RNAseq-SSR مورد ارزيابي قرار گرفت . ١٢ جفت آغازگر استفاده شده در مجموع ٦٤ آلل را آشکار کردند، تجزيه خوشه اي بر اساس ضريب تشابه جاکارد و روش UPGMA انجام شد و نشان داد که ارقام H وM٣ بيشترين تشابه را دارند. نتايج اين تحقيق نشان داد که نشانگرهاي RNA-seq SSR ابزار خوبي براي بررسي تنوع ژنتيکي بادام مي باشد و توصيه مي شود جهت برنامه هاي اصلاحي و شناسايي ارقام استفاده شود.
کلمات کليدي : بادام، نشانگر R Aseq-SSR، شناسايي مولکولي
١. مقدمه
بادام، با نام علمي Prunus dulcis متعلق به خانواده Rosaceae و زيرخانواده Pronoideae گياهي ديپلوييد و ١٦ کروموزومي است و هم رديف و خويشاوند هلو˓ شليل و آلو مي باشد و مي تواند با آنها تلقيح شود [١]. اين گياه عموما خود ناسازگار و از نظر خلوص ژنتيکي ناخالص است . از طرفي يکي از مهم ترين محصولات آجيلي عمده جهان بوده و توليد ميوه آن ارزش اقتصادي بالايي دارد [٢]. بادام داراي تنوع وسيعي از نظر شکل و فرم ريخت شناسي و جغرافيايي مي باشد [٣]. آگاهي از تنوع ژنتيکي ومديريت منابع ژنتيکي يکي از اجزاي مهم برنامه هاي اصلاح نباتات تلقي مي شود زيرا ضمن حفاظت از ذخاير ژنتيکي ، قابليت استفاده آن ها را در برنامه هاي اصلاحي افزايش مي دهد .[4]
روش هاي مولکولي متعددي براي ارزيابي تنوع ژنتيکي و تشخيص ذخاير توارثي در گياهان ابداع شده اند. در اين ميان˓ ريز ماهوارهها يا توالي تکراري ساده (SSR) به علت دارا بودن مزايايي از قبيل سيستم چند اللي ˓ بروز هم بارز˓ قابليت تکرار آسان و توزيع وسيع و تصادفي در طول ژنوم کاربرد وسيعي در انگشت نگاري DNA داشته و به عنوان نشانگرهاي انتخابي در بسياري از برنامه هاي اصلاح گياهي مي باشند [٥]. يکي از انواع روشهاي توالي يابي با توان بالا که اخيرا براي بررسي ترنسکريپت ها در سطح وسيع استفاده مي شود روش RNA sequencing( RNA-seq) است که شامل توالي يابي کل cDNA مربوط به سلول يا يک بافت خاص، مي باشد. اين روش براي بررسي ترنسکريپت هاي جديد (کد شونده و غيرکدشونده)، شناسايي انواع اسپلايس هاي ژن، تجزيه و تحليل بيان ژن و کشف SNPهاي درون ژن مورد استفاده قرار مي گيرد [٦]. نشانگرهاي مبتني بر mRNA همچون Est-SSR و RNAseq-SSR به علت نشان دادن تنوع در مناطق رونويسي شونده مي توانند تخمين دقيق تري از تنوع عملکردي را فراهم کنند. در اين پژوهش از توالي هاي RNA-seq بادام که توسط موسوي و همکاران [٧] گزارش شد، استفاده گرديد. هدف از اين بررسي ، ارائه اطلاعات در مورد ساختار ژنتيکي جمعيت هاي ايراني و خارجي بادام و يافتن ارتباط و تنوع ژنتيکي موجود ميان اين ارقام مي باشد.
٢. مواد و روشها
مواد گياهي مورد استفاده در اين پژوهش شامل ١٩ رقم بادام (١٠ رقم ايراني و ٩ رقم خارجي ) بود که از مؤسسه نهال و بذر کرج تهيه شدند. استخراج DNA با استفاده از روش تغييريافته CTAB [٨] انجام شد. در اين پژوهش از توالي هاي RNA-seq بادام که توسط موسوي و همکاران (٢٠١٤) گزارش شد، استفاده گرديد که شامل کل توالي هاي RNAي استخراج شده از بساک و تخمدان ژنوتيپ H بادام تحت دو شرايط کنترل و سرماي ٢- بود. ١٢ جفت آغازگر RNAseq-SSR، با استفاده از نرم افزار SSR LOCATOR طراحي و براي تکثير DNA استفاده شدند. تکثير DNA با استفاده از يک دستگاه ترموسايکلر ايندورف و به صورت Touch down انجام شد. در نهايت فرآورده هاي PCR بر روي ژل ٨ در صد پلي اکريل اميد غير واسرشت ساز بارگذاري و الکتروفورز شدند. رنگ آميزي ژل پلي اکريل آميد با اتيديوم برمايد انجام شد (شکل ١). رتبه بندي باندها به صورت ١ براي وجود باند و ٠ براي عدم وجود باند انجام گرفت و ماتريس داده هاي خام تشکيل داده شد. ماتريس مذکور براي به دست آوردن فواصل ژنتيکي و رسم دندروگرام با استفاده از نرم افزار [٩] j٢١ NTsys مورد استفاده قرار گرفت . همچنين تنوع ژنتيکي ، شاخص شانون، فاصله ژنتيکي بر اساس (١٩٧٨ ,Nei) ، جريان ژني ، در نرم افزار GenAlex [١٠] مورد محاسبه قرار گرفت .
