بخشی از مقاله
چکیده
در این تحقیق از نشانگر مولکولی RAPD جهت بررسی تنوع ژنتیکی میان سوش JH-82 و 10 سوش جهش یافته مخمر Phaffia rhodozyma استفاده گردید و میزان خویشاوندي آنها تعیین شد. نشانگر مولکولی RAPD از جمله روشهاي مولکولی مبتنی بر DNA است که بطور گسترده اي در انگشت نگاري DNA و مطالعه تنوع ژنتیکی جوامع زیستی مختلف مورد استفاده قرار می گیرد.
آنالیز RAPD با استفاده از 10 آغازگر و 11 سوش مخمر فافیا انجام شد که در نهایت 95 باند تولید گردید. از این 95 باند تولید شده 38 باند - %37/5 - چند شکلی نشان دادند. بیشترین تعداد بانددهی مربوط به آغازگر J20 و کمترین تعداد بانددهی مربوط به آغازگر F بود. درصد چندشکلی از %0 در آغازگر F تا %70 براي آغازگر A16 متغیر بود و متوسط بانددهی براي هر آغازگر 9/5 بدست آمد.
تجزیه ي کلاستر بر اساس حضور یا عدم حضور باند با استفاده از ضریب تشابه جاکارد به روش UPGMA انجام گرفت و بر اساس دندروگرام حاصل، نمونه ها در 4 گروه طبقه بندي شدند که سوش JH-82 در یک گروه مجزا از سوش هاي جهش یافته قرار گرفت. بیشترین شباهت بین سوش هاي Gam4 و Gam10 و کمترین شباهت بین سوش هاي JH-82 و Gam9 بود. ما پیشنهاد می کنیم که نشانگر مولکولی RAPD می تواند یک روش قابل اطمینان و سریعی به منظور تعیین تفاوت ژنتیکی میان سوش هاي مختلف مخمر P. rhodozyma باشد.
مقدمه
Phaffia rhodozyma یک مخمر قرمز رنگ است که آستاگزانتین را به عنوان رنگدانه اصلی کاروتنوئیدي تولید می کند. آستاگزانتین نه تنها به عنوان منبع رنگدانه مورد توجه تجاري است بلکه به عنوان یک آنتی اکسیدانت قوي نیز می باشد و در صنعت آبزي پروري و مرغداري و صنایع آرایشی و بهداشتی کاربرد دارد 2 - ، . - 3 اشعه گاما می تواند یک روش موثر جهت افزایش غلظت آستاگزانتین در مخمر فافیا باشد
هدف از این مطالعه مقایسه خصوصیات ژنتیکی مخمر فافیا سوش JH-82 - با غلظت پایین آستاگزانتین - با سوش هاي جهش یافته - با غلظت بالاي آستاگزانتین - مخمر فافیا می باشد. بررسی مولکولی سوش JH-82 و سوش هاي جهش یافته با استفاده از نشانگر مولکولی RAPD انجام شد.
روش RAPD یکی از روشهاي مولکولی است که به دلیل مزایایی چون عدم استفاده از مواد رادیو اکتیو، تعداد باندهاي نامحدود، مراحل کاري کوتاه، سرعت و سهولت کاربرد آن، نیاز به DNA ژنومی کم، عدم نیاز به وجود اطلاعاتی در مورد توالی ژنومی نمونه ها و هزینه پایین در تعیین تفاوت و تنوع درون گونه اي در میکروارگانیسم ها بطور گسترده اي مورد استفاده قرار گرفته است
وارگا و همکاران در سال 1995 مطالعه اي روي تفاوت ژنتیکی میان سوش هاي مختلف CBS5905 - ، CBS5908، CBS6938، ATCC24203، ATCC24229 و - ATCC24291 فافیا رودوزیما با استفاده از RFLP و RAPD انجام دادند. در این مطالعه آنالیز RAPD روي 6 سوش مخمر فافیا با استفاده از 9 آغازگر تصادفی ده نوکلئوتیدي انجام شد. در نهایت تنها الگوهاي RAPD با 2 آغازگر براي6 سوش مورد مطالعه بدست آمد. از یکی از آغازگرها فقط 3 باند و در آغازگر دیگر 6 باند تکثیر شد که 4 باند در6 سوش مشترك بود و 2 باند فقط در یک سوش مشاهده گردید. ضریب کوفنتیک حاصل از دندروگرام ترسیم شده برابر 0/95 بود.
در آنالیز RFLP، الگوهاي DNA ي تکراري در تمامی سوش هاي فافیا رودوزیما پس از برش با آنزیم هاي SmaΙ - در تمامی سوش ها 3 باند - و EcoRΙ - در تمامی سوش ها 2 باند - بدست آمد. نتایج نشان داد که الگوهاي حاصل از DNA در آنالیز RFLP فقط درجه محدودي از تنوع ژنتیکی را نشان داد به طوري که تمامی سوش ها در یک گروه قرار گرفتند. در حالی که آنالیز RAPD روش موثرتري براي مشاهده این تفاوت ها در سوش هاي مورد مطالعه مشخص گردید، به طوري که سوش CBS5905، الگوهاي RAPD متمایزي از سایر سوش ها نشان داد.
پالاژیا و همکاران در سال 2004 مطالعه اي با استفاده از 5 آغازگر تصادفی ده نوکلئوتیدي روي 16 سوش مخمر Phaffia، Xanthophyllomyces و Cryptococcus انجام دادند. در این مطالعه الگوهاي RAPD در تمامی نمونه ها مشاهده گردید و بر پایه ي داده هاي حاصل از واکنش RAPD با استفاده از روش UPGMA و ضریب تشابه جاکارد، دندروگرام رسم گردید که در این دندروگرام سوش ها در3 کلاستر A، B و C گروه بندي شدند.
همچنین از دندروگرام ترسیم شده، 4 سوش در هیچ یک از این گروه ها، گروه بندي نشده بودند. ضریب کوفنتیک حاصل برابر 0/98 بود.
تربائول و همکاران در سال 2001 مطالعه اي با استفاده از نشانگر مولکولی RAPD به منظور تشخیص تنوع ژنتیکی در 37 سوش مخمر Xanthomonas cynrae انجام دادند. از میان 340 آغازگر تصادفی ده نوکلئوتیدي RAPD آزمایش شده، تنها 40 آغازگر تصادفی به منظور انگشت نگاري ژنوم سوش ها انتخاب گردید. این 40 آغازگر الگوهاي بانددهیتقریباً مشابهی را در 37 سوش .X. cynrae تولید کردند. پس از ترسیم دندروگرام، سوش ها در یک گروه ژنتیکی واحد، دسته بندي شدند که براي این گروه، 3 زیرگروه A1 - ، A2 و - B در نظر گرفته شد که فاصله ژنتیکی A1، B و A2، B به ترتیب برابر 0/177 و 0/185 بود.
گوسدینر و همکاران در سال 2009 مطالعه اي روي تنوع ژنتیکی میان سوش استاندارد، وحشی و جهش یافته Monascus spp. با استفاده از 2 آغازگر تصادفی ده نوکلئوتیدي، توسط روش RAPD انجام دادند. در این مطالعه سوش جهش یافته از جهش زایی با ماده EMS بدست آمد. سوش استاندارد و وحشی داراي الگوي باندي یکسان بودند اما یکی از باندهاي سوش جهش یافته با اندازه ي 1150 bp در سوش استاندارد و وحشی مشاهده نگردید که به نظر می رسد که این باند نتیجه ي تنوع ژنتیکی حاصل از فرایند جهش باشد.
دو جنبه مورد بررسی در این تحقیق، یکی بررسی تفاوت ژنتیکی میان سوش پایه JH-82 و 10 سوش جهش یافته حاصل از آن طی پرتوتابی با اشعه گاما توسط آنالیز RAPD و دیگري تخمین روابط خویشاوندي میان آنها توسط تجزیه خوشه اي می باشد.
مواد و روشها
سوشهاي مخمر و محیط کشت 11 سوش مخمر Phaffia rhodozyma - جدول - 1 تهیه شد. در این تحقیق از سوش هاي جهش یافته Gam1، Gam2، Gam3، Gam4، Gam5، Gam6، Gam7، Gam8، Gam9، Gam10 که از جهشزایی سوش Phaffia rhodozyma JH-82 طی پرتوتابی با اشعه گاما بدست آمده بود و سوش JH-82، استفاده گردید. سوش ها در محیط کشت مایع YMB - عصاره مالت 3 گرم در لیتر، عصاره مخمر 3 گرم در لیتر، باکتو پپتون 5 گرم در لیتر، گلوکز 10 گرم در لیتر - کشت داده شد.
استخراج DNA
پس از اینکه سوش ها در محیط کشت YMB مخمر به مدت 24 ساعت رشد داده شد، DNA آنها با استفاده از روش چونگ - 1996 - با اندکی تغییرات استخراج گردید کمیت و کیفیت DNA استخراج شده با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر - مدلCE250L، شرکت Bio Quest، انگلستان - و الکتروفورز ژل آگارز %1 تعیین شد.
تجزیه RAPD
در این مطالعه از 10 آغازگر 10 نوکلئوتیدي استفاده گردید - جدول - 2 - سیناژن، تهران، ایران - . واکنش PCR در حجم نهایی 20 میکرولیتر و با استفاده از کیت مستر میکس PCR انجام شد. بر این اساس پس از اضافه نمودن آب مقطر استریل تا حجم نهایی 20 میکرولیتر ، 10 میکرولیتر از محلول مستر میکس - 1x - PCR و 1 میکرولیتر از آغازگرها - با غلظت - 10Pmol و1 میکرولیتر از DNA الگو - با غلظت - 100ng به مخلوط واکنش اضافه شد و با برنامه حرارتی 4 دقیقه در 94 درجه سانتیگراد، 40 چرخه با 30 ثانیه در 94 درجه سانتیگراد، 45 ثانیه در 36 درجه سانتیگراد، 1 دقیقه و 45 ثانیه در 72 درجه سانتیگراد و مرحله تکثیر نهایی با 5 دقیقه در 72 درجه سانتیگراد با استفاده از دستگاه ترمال سایکلر - مدل PTC – 1148، شرکت BioRAD، امریکا - انجام شد. محصولات PCR در ژل آگارز % 1/5 - w/v - و بافر 0/89 - TBE مولار Tris –base با pH=8، 0/89 مولار Boricacid ،0/02 مولار - EDTA در ولتاژ ثابت90 میلی ولت به مدت 90 دقیقه الکتروفورز شد و سپس ژل در محلول اتیدیوم بروماید - یک میکروگرم بر میلی لیتر - رنگ آمیزي شد و با استفاده از دستگاه مستندساز ژل - GelDoc - - مدل G:BOX HR، انگلستان - از آن عکس تهیه شد.
جدول.1 لیست سوشهاي مخمر فافیا رودوزیما تولید کننده آستاگزانتین.
جدول .2 توالی نوکلئوتیدي آغازگرهاي استفاده شده در واکنش .RAPD
