بخشی از مقاله
چکیده
توسکا یکی از عناصر اصلی درختی جنگل هیرکانی است که تاکسونومی آن همچنان مورد ابهام است. برای این منظور نمونه برداری از برگ گونههای تازه شنا سایی شده 8 - تاک سون - انجام،DNA ا ستخراج و تاک سونومی آنها به روش ISSR صورت گرفت. در این مطالعه با استفاده از 4 پرایمر 383 آلل مشخص در محدوده 100-1200 مشاهده شد. میانگین شاخص شانون و هتروزیگوسیتی برای گونههای مورد مطالعه به ترتیب 0/102 و 0/040 تا 0/81 متغییر میباشد.
بیشترین و کمترین هتروزیگوسیتی در میان گونهها مربوط به A. glutinosa ssp. barbata و A. orientalis بود. نتایج حاصل از آنالیز واریانس مولکولی بیانگر در صد بالایی از تنوع درون گونهها ست، به نحوی که %93، تنوع درون جمعیتی و تنها %7 تنوع بین جمعیتی مشاهده میشود. براساس شاخص شباهت ژنتیکی Nei بیشترین فاصله ژنتیکی بین گونه A. glutinosa ssp. barbata و A. orientali مشاهده شد.
مقدمه
شناخت صحیح و دقیق ردهبندی و جایگاه گونهها در شبکه ها و هرمهای موجود تاثیر بسزایی در موفقیت مدیریت طبیعت در یک اکوسیستم بر عهده دارد [1]، که لازمه آن شناسایی صحیح گونهها برای تحقیقات زیستی است. .[2] کشور ایران با تنوع اقلیمی و جغرافیایی و به دلیل قرار گرفتن در پهنه ای که نقطه تلاقی سه ناحیه رویشی اروپا B سیبری، ایران B تورانی و خلیجی B عمانی میباشد که از تنوع گونهای قابل توجهای برخوردار است و تا به امروز 8000 گونه گیاهی در آن شناسایی شده است
از آنجایی که بسیاری از گیاهان و ویژگی های اکولوژیکی جنگل های هیرکانی ناشناخته هستند و همچنین این جنگلها قدیمی که به واسطه موانع طبیعی در آخرین عصر یخبندان پناهگاه امنی برای بسیاری از گونه های پهن برگی بوده که در قفقاز و اروپا از بین رفته است این مساله باعث شده است که این ناحیه فرصت مناسبی را برای توسعه تحقیقات فراهم کند
جنس توسکا - Alnus Mill - از تیره توس - Betulaceae - دارای 35-29 گونه [5]، در سراسر نیمکره شمالی در عرضهای 25 درجه جنوبی تا 70 درجه شمالی در اروپا و کوههای آند در نیمکره جنوبی پراکنش دارد .[6] البته شناسایی صحیح گونههای این جنس به همراه تعیین نیازهای اکولوژیک آنها، میتواند ضمن افزایش شانس سازگاری گونهها با شرایط محیطی، موفقیت برنامههای احیای را نیز تضمین نماید
بر اساس مطالعات فیلوژنی و جغرافیای زیستی جنس توسکا، با استفاده از دادههای مولکولی و ریختی، از 35-29 گونه توسکای موجود در جهان، در حال حاضر 9 گونه در قاره آمریکا، 4-5 گونه در اروپا و 18-23 گونه نیز در آسیا پراکنش دارند .[8] این در حالی است که بر اساس آخرین نتایج ارائه شده در بانک داده گونههای گیاهی، تاکنون تعداد 44 گونه و 62 تاکسون برای این جنس ثبت شده است
ثابتی [10] و [11] %URZL V در فلور ایرانیکا یک زیرگونه از توسکای قشلاقی به نام Alnus glutinosa ssp. barbata - C. A. Mey. - به همراه دو واریته از توسکای ییلاقی به نامهای A. subcordata var. subcordata - C. A. Mey. - و A. subcordata var. villosa - Regel - H.J.P.Winkl را ذکر نمودهاند. این در حالی است که Zare و [12] Amini بر اساس تحقیقات جدید، توسکاهای ایران را 8 تاکسون ذکر نمودند.
بر این اساس دو زیرگونه از توسکای قشلاقی به نامهای A. glutinosa ssp. glutinosa - L. - Gaertn و - A. glutinosa ssp. antitaurica Yalt.که قبلاً در فلور اروپا و ترکیه ذکر شده بودند - و نیز یک گونه توسکای بومی مناطق مدیترانهای به نام A. orientalis Decne. به همراه دو گونه نو ظهور و جدید به نامهای A. dolichocarpa Zare, Amini and Assadi و A. Djavanshirii Zare به فهرست گونههای توسکای ایران افزوده شدهاند.
همچنین در مطالعهای توسط شایانمهر و همکاران[13] مشخص شد که ساختار ثانویه ITS2 در مجموعه A. glutinosa متفاوت با A. subcordata بود. تاکسونهای توسکای هیرکانی با استفاده از توالی ITS در دو کلاد مجزا، یکی متشکل از سه زیر گونه A. glutinosa و دیگری متشکل از سایر گونهها به همراه مجموعه A. subcordata بود که در مقایسه با نمونههای A. orientalis برگرفته از بانک ژن، در کلادی مجزا از نمونههای منتسب به A. orientalis جنگلهای هیرکانی قرار گرفتند. این یافته، محتمل بودن عدم حضور گونه مزبور در جنگلهای هیرکانی ایران را تقویت میکند.
ساختار ثانویه ITS1 کلیه تاکسونهای هیرکانی مشابه بود. نشانگر کلروپلاستی trnH-psbA نیز از قدرت تفکیک کمتری نسبت به ITS1 برخوردار بود و کلیه تاکسونهای هیرکانی را در یک کلاد قرار گرفتند. و در نهایت گزارش کردند که مطالعه همزمان دو نشانگر ITS و trnH-psbA نیز نمیتواند تاکسونهای هیرکانی را در بیش از دو کلاد ذکر شده طبقهبندی نماید. مجموع این دلایل سبب شد تا مطالعه حاضر به بازبینی ردهبندی مولکولی این جنس در جنگلهای هیرکانی بر اساس نشانگر هستهای ISSR شکل بگیرد.
مواد و روشها
نمونهبرداری:
از آنجایی که توسکامعمولاً در لکههای کمتر از 200 متر مربع تا تودههای نواری بزرگتر در حاشیه رودخانهها حضور پیدا میکند، نمونهها تنها از شاخههای در معرض آفتاب تهیه شدند. نمونهها پس از جمع آوری و انجام مراحل آماده سازی جهت استخراج به آزمایشگاه انتقال داده شد. جدول - 1 - موقعیت جغرافیایی رویشگاه های مختلف توسکا در جنگلهای هیرکانی مورد استفاده در این تحقیق را نشان میدهد.
جدول -1 موقعیت جغرافیایی رویشگاه های مختلف توسکا در نمونه برداری
استخراج DNA و فرآیند PCR :
برای استخراج DNA ژنومی توسکاها، روش ترکیبی [14] Doyle و روش [15] Dellaporta مورد استفاده قرار گرفت. سپس با انتخاب پرایمرها - جدول - 2 مورد نظر وارد مراحل فرآیند PCR شد این فرآیند شامل سه مرحله میباشد که شامل 5 دقیقه در دمای 94 درجه سانتیگراد به منظور واسرشت اولیه، 30 چرخه با دمای 94 درجه سانتیگراد 30 ثانیه، 54 درجه سانتیگراد 45 ثانیه و 72 درجه سانتیگراد 2 دقیقه و در نهایت به مدت 5 دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد انجام شد. پس از بارگذازی محصول PCR بر روی ژل اکریل آمید، رتگ آمیزی آن به روش نیترات نقره انجام و الگوی نواری باندها مشاهده شد.
جدول -2 توالی پرایمرهای ISSR مورد استفاده در این تحقیق
پس از علامت گذاری محل باندهای PCR، تمامی پایهها بر اساس وجود و عدم وجود هر باند در هر پایه به صرت دودویی و با کد صفر ویک به ترتیب کددهی شدند. با استفاده از نرم افزار GenAlEx شاخص تشابه بر اساس کسر باندهای رایج در هر جفت پایهها بر اساس ضریب Nei به همراه سایر پارامتر های ژنتیکی از قبیل درصد جایگاه چند شکلی، تنوع ژنتیکی کل، تنوع داخل هر جمعیت، سهم تنوع داخل و برون جمعیتی، محاسبه شد.
نتایج
در این مطالعه با استفاده از 4 پرایمر 383 آلل مشخص در محدوده 100-1200 مشاهده شد . این تعداد آلل مربوط به 21 نمونه متعلق به 8 گونه میباشد. درصد جایگاه پلیمورفیک - Pp - ، تعداد الل موثر - Ne - ، تنوع ژنتیکی براساس شاخص Nei - h - و شاخص شانون - I - در جدول3 نشان داده شده است. میانگین شاخص شانون برای گونههای مورد مطالعه0/102 میباشد.
