بخشی از مقاله
چکیده
نشانگرهاي مولکولی به طور موفقیتآمیز براي ارزیابی تنوع ژنتیکی در گیاهان زراعی مورد استفاده قرار گرفتهاند. در این راستاتحقیقی براي بررسی تنوع ژنتیکی میان 45 رقم و لاین جو، با استفاده از نه آغازگر ISSR انجام شد. در مجموع 438 نوارچندشکل با طول 80-3000 جفت باز تولید شدند. میزان اطلاعات چند شکلی نشانگرها از 0/121 براي ISSR7 و 0/227برايISSR2 با میانگین 0/19 متغیر بود. شاخص نشانگر نیز از 1/694 براي ISSR7 و 22/448 براي ISSR9 با میانگین 8/99 بهدست آمد. گروهبندي ژنوتیپهاي جو مورد مطالعه بر اساس دادههاي مولکولی با استفاده از الگوریتم Neighbor Joining و بر مبناي ضریب فاصله Number of Differences، ژنوتیپها را به شش گروه تقسیم کرد.
واژههاي کلیدي: تنوع ژنتیکی، جو پاییزه، میزان اطلاعات چند شکلی، نشانگرهاي ISSR
مقدمه
گسترش نشانگرهاي DNA سبب غلبه بر برخی مشکلات اصلاحی و ژنتیکی موجودات شدهاست. در بین نشانگرهاي مبتنی برDNA، نشانگرهاي 1ISSR به علت چند شکلی بیشتر، تکرار پذیري بالا، توزیع ژنومی بالا و تصادفی، مشخص بودن محل کروموزومی، سهولت استفاده و قابلیت کاربرد آنها در بررسی ژنوتیپها و تهیه نقشه ژنومی به عنوان نشانگرهاي مناسب درمطالعات ژنتیکی محسوب میشوند . - 4 - ال-ائودي و همکاران - 3 - تنوع ژنتیکی جو را توسط نشانگرهاي ISSR و RAPDمورد مطالعه قرار دادند. از 10 آغازگر ISSR ، 7 آغازگر و از 20 آغازگر RAPD، 13 آغازگر الگوي نواري مناسب تولید کردند. در تجزیه 2RAPD، 111 نوار تولید شد که 61 نوار چند شکل - 54/%9 - بودند و تعداد نوار براي هر آغازگر RAPD بین 5 تا15 با میانگین 8/54 تولید شد. بر اساس تجزیه ISSR ، 53 نوار تولید شد که 16 نوار چند شکل - 30/%2 - بودند و تعداد نواربراي هر آغازگر ISSR بین 5 تا 10 با میانگین 7/57 متغیر بود.
میزان اطلاعات چند شکلی 3 - PIC - براي نشانگرهاي RAPDو ISSR به ترتیب 0/45 و 0/37 بود. آنان بیان کردند که نشانگرهاي ISSR مناسبتر از نشانگرهاي RAPD براي بررسی تنوع ژنتیکی میان ارقام جو هستند. در مطالعه دیگر روي جو میزان نوار چند شکل براي نشانگرهاي ISSR و RAPD به ترتیب 72/2 درصد و 61 درصد بود. در این تحقیق، نسبت چند گانه مؤثر 4 - EMR - ، PIC و شاخص نشانگر 5 - MI - براي مقایسه نشانگرهاي ISSR و RAPD به کار گرفته شد. مقدار این سه پارامتر براي نشانگرهاي ISSR مورد استفاده بیشتر ازRAPD به دست آمد. تجزیه خوشهاي بر اساس دادههاي این دو نشانگر نیز ژنوتیپهاي جو را از بعد زمینه ژنتیکی و منشا جغرافیایی به خوبی از هم تفکیک کرد . - 2 - هدف از اجراي این تحقیق، بررسی تنوع ژنتیکی و گروهبندي ارقام جو پاییزه بااستفاده از نشانگرهاي مولکولی بود.
مواد و روشها
مواد گیاهی شامل 45 رقم و لاین جو پاییزه بود - شکل - 1 که توسط موسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال بذر تأمین شدند.DNA ژنومی از برگهاي جوان با استفاده از روش سقاي معروف و همکاران - 6 - استخراج شد. کمیت و کیفیت نمونههايDNA به روش اسپکتروفتومتري و الکتروفورز ژل آگارز 0/8 درصد تعیین شد. سپس غلظت نمونهها به مقدار 25 نانوگرم درمیکرولیتر براي استفاده در واکنش زنجیرهاي پلیمراز رقیق شد. نه آغازگر چند شکل با الگوهاي نواربندي مناسب استفاده شد - جدول . - 1 واکنش زنجیرهاي پلیمراز در حجم 10 میکرولیتر انجام شد. چرخههاي حرارتی شامل یک چرخه واسرشته سازي اولیه در دماي 94oC به مدت 5 دقیقه، 35 چرخه واسرشته سازي در 94oC به مدت یک دقیقه، اتصال آغازگر در 60-49oC - بسته به آغازگر - به مدت یک دقیقه، بسط در دماي 72oC به مدت دو دقیقه و در انتها یک چرخه بسط در 72 oC به مدت 7دقیقه بود. تفکیک محصولات تکثیري به کمک الکتروفورز ژل پلی آکریلامید %4 در الکتروفورز عمودي - Gel-Scan 3000 - ،ساخت شرکت CORBITT ROBOTICS استرالیا انجام شد. قطعات تکثیري با قلم لیزري شناسایی شدند. اتیدیوم برومایدبراي رنگ آمیزي ژل به کار رفت.
نشانگر وزن مولکولی - # SM0321 Fermentas - 1 براي تعیین اندازه نسبی قطعات تکثیري در چاهکهاي ابتدایی، میانی و انتهایی ژل، بارگذاري شد. الگوهاي نواري حاصل به صورت وجود و عدم وجود نوار امتیازدهی شدند. امتیازدهی ژلها با استفاده از نرم افزار 1Dscan EX 3.1 صورت گرفت. PIC براي هر نشانگر از رابطه 1- p2 – q2 به دست آمد که در آن p فراوانی الل تولید کننده نوار و q فراوانی الل فاقد نوار بود. به منظور برآورد PIC براي هر آغازگر مستقل، میانگین حسابی PIC نشانگرها، محاسبه شد. MI از رابطه MI= EMR×PIC به دست آمد که در آن EMR، نسبت چند گانه مؤثر و برابر با Np - Np/N - بود که در آن Np، تعداد نشانگرهاي چند شکل و N، تعداد کل نشانگرهاي حاصل از یک آغازگر بود . - 5 - چون کلیه نشانگرها چند شکل بودند، بنابراین N=Np و در نتیجه EMR=N بود و MI از رابطه N×PIC به دست آمد. براي گروهبندي ژنوتیپها، تجزیه کلاستر توسط الگوریتم Neighbor Joining و ضریب فاصله Number of Differences با نرم افزار MEGA4 انجام شد.
نتایج و بحث
در کل، 438 نشانگر چند شکل با طول 80 تا 3000 جفت باز در ژنوتیپهاي جو تولید شدند. PIC از 0/121 تا 0/227 بامیانگین 0/19 برآورد شد. ISSR7 کمترین و ISSR2 بیشترین PIC را داشتند. MI بین 1/694 تا 22/448 با میانگین 8/99برآورد شد. ISSR7 از کمترین و ISSR9 از بیشترین MI برخوردار بودند. در یک آزمایش در جو، با استفاده از نشانگرهايISSR، 67 نوار تولید شد که از این میان 52 نوار چندشکل - %78 - بودند. در آغازگرهاي مورد استفاده 12 نوار منحصر به فرد شناسایی شد که به عنوان نشانگرهاي مولکولی احتمالی براي برنامههاي اصلاحی جو معرفی شدند . - 1 - در پژوهش حاضرمیانگین PIC تا حدي پایین و مقدار MI بالا بود که علت آن میتواند تعداد بالاي نشانگرها در هر آغازگر در کل جمعیت وچند شکلی همه آنها باشد.تجزیه خوشهاي ژنوتیپها را به شش گروه تقسیم کرد - شکل . - 1 از این طریق میتوان ژنوتیپهاي واقع در گروههاي دور ازهم را به عنوان والدین در تلاقیها مورد استفاده قرار داد. در این گروهبندي 10 رقم تجاري در یک گروه قرار گرفتند. ژنوتیپ هاي داراي شجره مشابه نیز در یک خوشه جا گرفتند. به طور کلی نشانگرهاي مورد استفاده توانستند ژنوتیپهاي جو تحتمطالعه را از هم تفکیک کنند. سایر محققان نیز کارایی نشانگرهاي ISSR را براي بررسی تنوع ژنتیکی گزارش کردهاند 2 - ، . - 3
نتیجهگیري
آغازگرهاي ISSR مورد استفاده توانستند ژنوتیپهاي جو را از یکدیگر تفکیک دهند. از تنوع ژنتیکی بین ژنوتیپهاي مورد مطالعه نیز میتوان در برنامههاي اصلاحی و انجام تلاقی بین ژنوتیپها، به منظور بهبود عملکرد جو بهره برد.
سپاسگزاري
این تحقیق در آزمایشگاه ژنومیک و اصلاح نباتات مولکولی، گروه بهنژادي و بیوتکنولوژي گیاهی دانشکده کشاورزي دانشگاه تبریز و با اعتبار قطب علمی اصلاح مولکولی غلات دانشگاه تبریز انجام شد.
